Bacillus stearothermophilus NO2環糊精葡萄糖基轉移酶Leu277突變提高α-環糊精產量

孔德民,左方圓,吳敬,王蕾*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

環糊精(cyclodextrin, CD)是一種由環糊精葡萄糖基轉移酶(cyclodextrin glucosyltransferase, CGTase)以淀粉為底物合成的環狀低聚糖[1],一般由6～8個吡喃葡萄糖單元構成,根據糖單元數量可分為α-環糊精(6)、β-環糊精(7)及γ-環糊精(8)。環糊精具有內部疏水及外部親水的空腔結構,可以和客體分子形成包合物進而增加其溶解性或穩定性[2]。因此環糊精被廣泛應用于制藥、化妝品、食品、紡織、污水處理等領域[3]。在3種環糊精中,α-環糊精水溶性高且具有抗消化酶水解特性,因此還可以作為可溶性膳食纖維促進腸道蠕動、調節腸道菌群。然而制備α-環糊精時合成和降解同時存在限制了產量的進一步提升,甚至存在明顯的產量下降趨勢[4],這些問題導致α-環糊精價格昂貴。因此提高α-環糊精產量是一項極有意義的研究。

CGTase的分子改造是一種提高α-環糊精產量的方法[3]。CGTase屬于α-淀粉酶家族[5],含有5個結構域[4]。催化中心由TIM(α/β)8結構組成,存在9個糖分子結合位點(-7～+2亞位點)用于結合供體分子及受體分子[4]。根據受體分子的不同,CGTase催化的反應被分為環化反應、歧化反應、偶聯反應及水解反應[6]。環化反應是CGTase生產環糊精的關鍵反應。然而由于存在多個底物結合亞位點,CGTase的環化產物是3種環糊精的混合物[4, 7]。部分來源的CGTase在合成α-環糊精上占據一定的優勢,如KlebsiellapneumoniaeM5a1 CGTase的環化產物中α-環糊精質量分數為73%,Thermococcussp.B1001 CGTase的環化產物中α-環糊精質量分數為51%[4],Paenibacillussp.602-1 CGTase的環化產物中α-環糊精質量分數為83%[8]。但是它們對底物的利用率均較低[4]。

此外,有研究報道指出了底物結合亞位點附近的氨基酸殘基位點對CGTase催化反應的影響,如-7亞位點主要影響環化反應特異性[4,7,9],-3亞位點影響環化活性[10],+1/+2亞位點主要影響受體分子的結合[6,11]等。近些年,一些研究者展示了定向進化或定點突變改造CGTase,從而提高α-環糊精占比的相關報道[3]。如LI等[12]構建PaenibacillusmaceransJFB05-01 CGTase突變體D372K/Y89R的產物中α-環糊精占比提高23.2%,WANG等[13]構建PaenibacillusmaceransJFB05-01的突變體Y89D的產物中α-環糊精占比提高7.6%,CHAO等[14]構建Bacillussp.602-1 CGTase的突變體Y167H/V536A產物中α-環糊精占比提高5.4%,WANG等[9]構建PaenibacillusmaceransJFB05-01 CGTase突變體R146P/D147A的產物中α-環糊精占比提高12.9%。

本研究選擇了表達水平較高[15]、總轉化率較高且穩定性較好[4]的B.stearothermophilusNO2 CGTase進行研究。參照之前的研究成果[7,11],本研究在CGTase的-7亞位點構建突變體E142P以提高CGTase的α-環糊精合成特異性,+1/+2亞位點構建突變體L277M、L277F及N353A以提高轉糖苷反應特異性。最終,通過檢測它們的轉化產物,E142P/L277M是最優的生產α-環糊精的突變體,其產量為10.15 g/L,較野生型提高1.7 g/L,并且α-環糊精占比較野生型提高14.3%。本研究為α-環糊精的工業化提供了新的思路,具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑、菌株及質粒

酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、甲基橙、酚酞、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、咪唑、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、α-環糊精、β-環糊精等,上海國藥生物科技有限公司;2×Phanta Max Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DpnI,大連TaKaRa生物科技有限公司。

EscherichiacoliJM109作為重組DNA操作的宿主菌。E.coliBL21作為CGTase表達的宿主菌。pET20b(+)/cgtase質粒參照TAO等[15]構建。

1.2 CGTase突變體質粒構建

使用pET20b(+)/cgtase作為模板質粒,使用表1中的引物1～4構建突變體L277M及L277F的質粒。

表1 定點突變引物

使用pET20b(+)/L277M及pET20b(-)/L277F作為模板質粒,使用表1中的引物5～8構建突變體E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A的質粒。同時,所有質粒在目的基因的C端均含有His-tag標簽,可用于蛋白純化。在PCR儀中進行擴增后,產物使用DpnI處理。最終轉化到E.coliJM109,提取質粒并測序。測序正確的質粒轉化到E.coliBL21(DE3)中用于后續目標蛋白的表達。

1.3 CGTase野生型及突變體的表達

將構建好的E.coliBL21(DE3)挑至LB(Luria-Bertani)液體培養基(含100 μg/mL的卡那抗生素)中,37 ℃、200 r/min條件下培養10 h作為種子液。按照體積分數5%的轉接量將種子液轉接至TB(Terrific-Broth)培養基(含100 μg/mL的卡那抗生素)中,37 ℃、200 r/min條件下培養2 h后調至25 ℃繼續培養48 h后終止發酵培養。將獲得的發酵液于8 000 r/min離心20 min后取上清液獲得粗酶液。

1.4 CGTase的酶活力測定

1.4.1 CGTase環化反應活性檢測

1.4.1.1 CGTase生成α-環糊精的酶活力檢測條件

反應條件為50 ℃及25 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液。酶反應體系包括2 mL上述緩沖液配制的1%可溶性淀粉及0.1 mL的適量稀釋的酶液。精確反應10 min后加入0.2 mL的3 mol/L HCl溶液終止反應,之后加入0.2 mL的0.44 mmol/L甲基橙溶液進行顯色。生成的α-環糊精能夠包埋甲基橙,使溶液在505 nm的吸光值降低,依照此制作標準曲線并計算α-環糊精的產量。α-環化反應酶活力定義為在上述反應條件下1 min內催化可溶性淀粉生成1 μmol α-環糊精所需要的酶量為1 U。

1.4.1.2 CGTase生成β-環糊精的酶活力檢測條件

反應條件為50 ℃及25 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液。酶反應體系包括2 mL上述緩沖液配制的1%可溶性淀粉及0.1 mL的適量稀釋的酶液。精確反應10 min后加入0.2 mL的0.6 mol/L HCl溶液終止反應,之后加入0.5 mL的0.6 mol/L的Na2CO3溶液并加入0.2 mL的1.2 mmol/L酚酞溶液顯色。生成的β-環糊精能夠包埋酚酞,使溶液在550 nm的吸光值降低,依照此制作標準曲線并計算β-環糊精的產量。β-環化反應酶活力定義為在上述反應條件下1 min內催化可溶性淀粉生成1 μmol β-環糊精所需的酶量為1 U。

1.4.2 CGTase水解反應活性檢測

水解反應酶活力主要指CGTase降解可溶性淀粉生成小分子糖的能力。反應條件為50 ℃及50 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液。酶反應體系包括1 mL上述緩沖液配制的1%可溶性淀粉、0.9 mL上述緩沖液及0.1 mL適量稀釋的酶液。精確反應10 min后加入3 mL DNS溶液終止反應,使用去離子水定容至15 mL。CGTase水解可溶性淀粉生成的小分子糖均為還原糖,能夠與DNS反應并顯色,依照此制作標準曲線并計算小分子糖的產量,最終檢測540 nm的吸光值確定小分子糖的生成量。水解反應酶活力定義:在上述反應條件下1 min內催化可溶性淀粉生成1 μmol麥芽糖當量所需的酶量為1 U。

1.5 α-環糊精的制備

在50 ℃及50 mmol/L、pH 5.5的磷酸鹽緩沖液條件下進行CGTase的催化反應制備α-環糊精。使用上述緩沖液配制5%可溶性淀粉作為底物,按照1 g底物5 U環化反應活性的加酶量添加CGTase,反應24 h并固定時間點取樣。取樣后煮沸滅活用于檢測。

1.6 HPLC檢測環糊精方法

使用HPLC檢測環糊精產量,色譜柱使用Aps-2 Hypersil(4.6 mm×250 mm),柱溫40 ℃,流動相為體積分數75%的乙腈,流速0.8 mL/min,檢測器為2414型(示差折光檢測器)。分別使用2、10、2 g/L的α-環糊精、β-環糊精及γ-環糊精作為標準品。按照1∶1的體積比添加乙腈至樣品中沉淀1 h后于12 000 r/min、2 min離心去除大分子底物,用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾后即可使用。

1.7 分子動力學(molecular dynamics, MD)結構模擬分析

以野生型B.stearothermophilusNO2 CGTase(PDB ID:1CYG)的三維結構作為模板,利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[16]模擬突變體E142P/L277M及L277M/N353A的三維結構。利用Amber18進行MD模擬,分別采用ff14SB(蛋白殘基)以及TIP3P(水分子)力場,在300 K的溫度下模擬10 ns。得到的軌跡利用AMBER18的capptraj分析其均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、均方根波動(root mean square fluctuation,RMSF)、關鍵氨基酸殘基Cα距離、回旋半徑(radius of gyration,Rg)及溶劑可及表面積(solvent accessible surface area, SASA)。

2 結果與分析

2.1 突變體質粒的構建及異源表達

參照KONG等[11]對CGTase的Leu277位點轉苷水解反應的研究結果,因其具有提高歧化反應并降低水解反應的作用,本文研究L277M及L277F突變體對α-環糊精產量的影響。同時,參照ZUO等[7]對α-環糊精產量的研究,在L277M及L277F突變體的基礎上組合E142P及N353A突變體進行研究。

使用E.coliJM109作為宿主,構建突變體L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A的質粒。使用E.coliBL21(DE3)作為表達宿主表達上述突變體。野生型及相關突變體CGTase的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析如圖1所示,均在60 kDa附近有可溶性條帶。環化反應活力檢測如表2所示,所有突變體的環化反應活力均比野生型低。此外,突變體E142P/L277M及E142P/L277F的α/β值分別提高至野生型的2.52及2.07倍,說明這2個突變體的環化反應特異性向合成α-CD方向偏移。此外,由于Leu277及Gln353位點相關突變體對CGTase水解反應的抑制,所有突變體的水解反應活力均低于野生型,其中L277M/N353A及L277F/N353A組合突變體的水解活力不足野生型的50%。

M-markers;1-野生型CGTase;2-L277M突變體;3-L277F突變體;4-E142P/L277M突變體;5-E142P/L277F突變體;6-L277M/N353A突變體;7-L277F/N353A突變體

表2 野生型與L277相關突變體CGTase的環化及水解活性

2.2 L277M及L277F突變體制備α-環糊精的應用

為了確定單突變體對環糊精產量的影響,使用5%可溶性淀粉作為底物進行酶轉化反應。L277M、L277F催化生成α-環糊精的最高產量分別為8.97和8.39 g/L(圖3),相較于野生型(8.45 g/L,圖2)均無明顯增加。同時,2種突變體在α-環糊精占比方面也未體現出明顯的優勢,均為35%左右,較野生型下降3%(表3)。參照KONG等[11]對Leu277相關突變體的分析,該位點影響受體亞位點附近的疏水性以及提高受體底物的親和力。根據之前的CGTase突變體的相關研究[4]:影響環糊精比例的氨基酸殘基位點位于供體位點,特別是—7亞位點。因此,L277M及L277F突變體可能并不能明顯提高α-環糊精的產量及占比。但是,由于2個突變體均降低了水解反應(表2),這導致反應體系中小分子糖的減少,從而能夠降低α-環糊精的降解。雖然單突變體L277M及L277F能夠減弱α-環糊精的降解,但由于其并未從根本改變α-環糊精的產量,因此并不能展現其優勢,進而導致突變體的α-環糊精產量及占比與野生型相當。

圖2 24 h內野生型CGTase合成環糊精的產量變化

a-L277M合成環糊精的產量變化;b-L277F合成環糊精的產量變化

表3 野生型及突變體CGTase的環糊精產物比較

2.3 E142P/L277M及E142P/L277F制備α-環糊精的應用

為了更好地利用L277M及L277F降低水解反應的優勢,本研究引入了突變體E142P。該位點能夠有效地提高產物中α-環糊精的占比(比野生型高9.65%[7]),但在反應后期存在嚴重的α-環糊精降解現象[4,7,9]。酶轉化結果顯示(圖4),E142P/L277M最高催化產生了10.15 g/L的α-環糊精,而E142P/L277F最高催化產生了9.63 g/L的α-環糊精。相較于野生型,兩者的產量均有提高。同時,對比ZUO等[7]報道的E142P最高催化產生約9.4 g/L的α-環糊精,該研究中的雙突變體的α-環糊精產量出現了小幅的提升。同時,相較于E142P突變體,E142P/L277M及E142P/L277F在催化反應后期較為穩定,α-環糊精未出現顯著的降解,這可能是由于Leu277突變體降低了水解的作用。

a-E142P/L277M合成環糊精的產量變化;b-E142P/L277F合成環糊精的產量變化

2.4 L277M/N353A及L277F/N353A制備α-環糊精的應用

為了進一步降低CGTase的水解反應,本研究引入了突變體N353A。該位點同樣能夠有效降低CGTase的水解反應,約為野生型的21.3%[7]。將其與L277M或L277F組合,嘗試以組合突變體制備α-環糊精。結果如圖5所示,L277M/N353A及L277F/N353A最高催化產生α-環糊精分別為7.12及8.21 g/L,較野生型更低。同時α-環糊精占比也比野生型更低(表3)。這可能是由于Asn353和Leu277在空間結構上距離較近,同時突變2個氨基酸殘基位點時,該處存在的疏水簇結構[11]或電荷平衡[7]可能遭到破壞,導致CGTase的結構較野生型更不穩定。

a-L277M/N353A;b-L277F/N353A

2.5 MD結構模擬分析

為解析突變體E142P/L277M的優勢所在以及L277M/N353A轉化率降低的原因,本研究使用MD結構模擬分析了野生型及2個突變體在10 ns內的軌跡變化。RMSD結果如圖6-a所示,3個結構在10 ns內均達到平衡狀態,其中L277M/N353A較其他2種結構更晚達到平衡。RMSF結果如圖6-b所示,L277M/N353A的RMSF在300位氨基酸殘基附近波動較大。此外,圖6-c顯示2個突變體中L277與N353之間的Cα距離高于野生型。上述結果表明L277M/N353A結構波動更大。針對L277及N353所在疏水簇[11]分析SASA,結果如圖6-d所示,L277M/N353A的SASA明顯增大,這可能是因為雙突變體破壞了疏水簇結構所致。此外,L277位點突變后自旋半徑增大(圖6-e),這與甲硫氨酸(M)側鏈長度增大有關;N353位點突變后自旋半徑降低,這與丙氨酸(A)側鏈長度降低有關。MD結果說明E142P/L277M突變體由于突變位點相互影響并不大,因此對α-環糊精的轉化產生了正向效應。與之相反,L277M/N353A突變體由于突變位點均位于疏水簇,對該區域影響較大,導致酶催化活力降低,因此對α-環糊精的轉化產生了負向效應。

a-野生型及突變體RMSD的結果;b-野生型及突變體RMSF的結果;c-L277與N353A的Cα距離;d-突變體及野生型的SASA變化;e-L277位點的自旋半徑;f-N353位點的自旋半徑

3 結論

本研究從降低CGTase水解反應及提高環化反應活力對其進行分子改造。L277M、L277F及N353A突變體雖然降低了CGTase的水解反應活力,但其本身對α-環糊精的特異性生產無明顯影響。L277M/N353A及L277F/N353A則導致CGTase的α/β值明顯降低,因此α-環糊精轉化率明顯降低。最終的優勢突變體為E142P/L277M,在24 h內最高催化生成了10.15 g/L的α-環糊精,較野生型α-環糊精產量提高1.7 g/L。此外突變體E142P/L277M生成的α-環糊精占比較野生型提高14.3%。整體而言,該研究為α-環糊精的生產應用提供了新的思路。