電針對佐劑性關節炎大鼠膝關節滑膜組織血管內皮生長因子受體2/細胞分裂周期蛋白42信號通路的影響

張亮，唐麗亞，龍軼映，曹佳男，劉梨，趙凌云，瞿啟睿，祁芳，艾坤

〔摘要〕 目的 觀察電針對佐劑性關節炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠膝關節滑膜組織內血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）/細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42， Cdc42）信號通路的影響，探究電針治療類風濕關節炎（rheumatoid arthritis， RA）的可能機制。方法 采用隨機數字表法將40只SPF級SD雄性大鼠分成空白組、模型組、西藥組和電針組，每組10只。模型組、西藥組、電針組大鼠采用尾根部皮下注射不完全弗氏佐劑（0.1 mL/只）制成AA大鼠模型。造模后第2天即開始干預，電針組進行電針干預，每次20 min，每天干預1次，共21次，西藥組給予甲氨蝶呤灌胃給藥，每周1次，共3次。觀察各組體質量、關節紅腫等一般情況；每3 d測量1次大鼠后雙側足跖容積，干預結束后，通過大鼠一般情況、體質量、足跖容積分析各組大鼠足跖腫脹程度， HE觀察各組大鼠滑膜組織的病理形態學變化，免疫組織化學法檢測膝關節滑膜組織內VEGFR2、CD34表達變化，Western blot檢測大鼠膝關節滑膜組織VEGFR2、Cdc42蛋白表達量。結果 與空白組相比，模型組大鼠第21天足跖容積均明顯增大（P＜0.01），膝關節滑膜組織出現了顯著性病理改變，CD34表達量明顯升高（P＜0.01），VEGFR2、Cdc42蛋白表達量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、電針組大鼠足趾容積明顯減?。≒＜0.01），膝關節滑膜組織病理改變明顯改善，VEGFR2、Cdc42表達量顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。結論 電針改善RA的作用機制可能與降低VEGFR2、Cdc42的表達從而抑制血管新生有關。

〔關鍵詞〕 佐劑性關節炎；電針；VEGFR2；Cdc42；血管新生；內皮細胞；偽足

〔中圖分類號〕R245.9? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.07.024

Effects of electroacupuncture on VEGFR2/Cdc42 signaling pathway

of knee synovial tissue in rats with adjuvant arthritis

ZHANG Liang1， TANG Liya1， LONG Yiying1， CAO Jianan1， LIU Li2， ZHAO Lingyun1， QU Qirui1，

QI Fang1*， AI Kun1*

1. School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture on vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2）/cell division cycle 42 （CDC42） signaling pathway of knee synovial tissue in rats with adjuvant arthritis （AA）， so as to explore possible mechanism of electroacupuncture in alleviating rheumatoid arthritis （RA）. Methods A total of 40 male SPF SD rats were randomly divided into blank group， model group， western medicine group， and electroacupuncture group， with 10 rats in each group. AA rat models were made by subcutaneous injection of incomplete Freund's adjuvant （0.1 mL/rat） at the tail root of rats in model， western medicine， and electroacupuncture groups. On the second day after modeling， the rats in electroacupuncture group were given electroacupuncture for 20 min， once a day， for a total of 21 times， while the rats in western medicine group were given methotrexate intragastrically once a week for 3 times. Then， the general conditions including redness and swelling of joints， body weight， and others in each group were observed. And the volume of bilateral hind paws was measured once every 3 days. After the intervention， the degree of paw swelling of rats in each group was analyzed through the observation of general conditions and the measurement of plantar volume. Meanwhile， the pathomorphological changes of knee synovial tissue was observed by HE staining， the expressions of VEGFR2 and CD34 in synovial tissue of knee joint were determined by immunohistochemistry （IHC）， and the protein expressions of VEGFR2 and Cdc42 were examined by Western blot. Results Compared with blank group， the plantar volume of rats in model group increased significantly on the 21st day （P<0.01）， the synovial tissue of knee joint showed significant pathological changes， the expression level of CD34， and the protein expression levels of VEGFR2 and Cdc42 were significantly higher （P<0.01）. Compared with model group， the plantar volume of rats in western medicine and electroacupuncture groups significantly reduced （P<0.01）， the pathological changes of synovial tissue of knee joint were significantly improved， and the expression levels of VEGFR2 and Cdc42 were significantly lower （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The mechanism of electroacupuncture in improving RA may be related to the inhibition of angiogenesis by reducing the expressions of VEGFR2 and Cdc42.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 adjuvant arthritis; electroacupuncture; vascular endothelial growth factor receptor 2; cell division cycle 42; angiogenesis; endothelial cells; pseudopod

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以侵蝕性關節滑膜炎癥為主要臨床表現的慢性自身免疫性疾病，血管翳是RA病變過程中的特征性產物，滑膜血管新生被認為是構成和維持血管翳的關鍵[1]。因此，抑制滑膜血管新生可作為治療RA的重要靶點之一。研究證實，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）及其信號通路參與血管新生的全部過程，血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）是影響血管生成重要的受體之一[2-3]。VEGFR2活化后可通過細胞內信號轉導途徑誘導其胞漿內位點Tyr1214磷酸化后激活細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42， Cdc42），促進內皮細胞偽足生成及其遷移，從而促進血管新生[4-5]。因此，抑制VEGFR2/Cdc42信號通路可作為抑制RA血管新生的重要思路。本課題組前期研究證實，電針能有效治療RA，緩解炎性反應，且組織形態學結果發現電針干預后滑膜血管新生受到抑制且未見明顯血管翳[6-7]；CHEN等[8]研究表明，電針調控子宮內膜細胞血管新生與VEGFR2表達密切相關。目前，圍繞電針抑制RA滑膜組織血管新生的機制研究尚不多見。因此，本研究選用佐劑性關節炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠模型，采用電針干預，從調控VEGFR2/Cdc42信號通路抑制血管新生角度，探討電針治療RA血管新生的作用機制，為電針治療RA的臨床運用提供科學支持。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供的40只SPF級SD雄性大鼠，體質量（100±10） g，動物合格證號：430727211101621817，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0009。40只大鼠以3只一籠飼養在湖南中醫藥大學動物實驗中心，飼養室溫度為（23±3） ℃，相對濕度60%±10%。適應性飼養7 d后開始實驗，按隨機數字表法將其分成空白組、模型組、西藥組、電針組，每組10只。實驗全程遵從《關于善待實驗動物的指導性意見》（2006年版）中動物倫理學有關條規，本實驗倫理編號：LLBH-202203140004。

1.2? 主要試劑與儀器

滅活結核分枝桿菌（美國BD公司，批號：231141）；礦物油（美國Sigma Aldrich公司，批號：M8410）；VEGFR2抗體、Cdc42抗體、β-actin抗體、Rabbit二抗（美國Proteintech Group公司，批號分別為26415、10155、20536、SA00001-2）。

華佗牌電針治療儀（蘇州醫療用品有限公司，型號：SDZ-Ⅱ型）；超凈工作臺（蘇州凈化設備廠，型號：SW-CJ-1FD）；高速低溫離心機（美國SCILOGBX公司，型號：D3024R）；電泳儀（美國BIO-RAD公司，型號：041BR126545）；GloMax酶標儀（美國Promega公司，型號：GM3030）；磁力恒溫攪拌器（金壇市城西峰崢嶸實驗儀器廠，型號：HJ-4A）；足跖容積測量儀（濟南益延科技發展有限公司，型號：YLS-7C）。

1.3? 模型制備

本實驗采用不完全弗氏佐劑注射尾根部皮下組織造成的佐劑性關節炎大鼠模型[9-10]。將定量的滅活結核分枝桿菌與礦物油在通風柜中混合研磨至溶液清透無雜質，制成2.5 mg/mL的不完全弗氏佐劑。然后依次將模型組、西藥組、電針組大鼠用異氟烷呼吸麻醉，用0.1 mL的微量注射器于尾根部皮下緩慢注射佐劑（0.1 mL/只）。觀察關節外表現進行模型評價，若大鼠出現足爪紅腫，全身及關節繼發癥狀，提示造模成功。大鼠造模3 d后尾根部開始紅腫，第9～12天尾根部脫皮甚至潰爛，后足關節出現紅腫，第15～18天到達峰值，后足紅腫加劇，甚至前肢、耳部也出現紅腫、體質量下降等。

1.4? 干預方法

于造模第2天開始干預，空白組、模型組大鼠以仰臥位固定于自制鼠板上20 min，不做其他處理，每天1次，共21次。電針組大鼠同法仰臥位固定于鼠板上，牙齒用牙線固定，使用華佗牌針灸針（0.25 mm×25 mm），遵循大鼠標準穴位定位圖譜定位，左側足三里與關元配穴，右側足三里與同側阿是穴配穴，接電針，選擇疏密波（20/50 Hz的頻率），電流強度通過觀察針柄處抖動情況來判斷，輕微抖動即可，留針20 min，每天1次，1個療程7次，共3個療程（21次）。西藥組使用陽性對照藥物甲氨蝶呤，按0.35 mg/kg每只計算灌胃給藥[11]，每周1次，共3個療程（3次）。

1.5? 取材

于干預第21天后禁食禁水，隔天在無菌操作臺上用刀片撥開大鼠膝關節囊，取出清透淡黃色的滑膜組織，放入做好標記的凍存管中，于液氮中保存。

1.6? 指標檢測

1.6.1? 一般情況觀察? 于實驗過程中觀察大鼠飲食、毛發、體質量、關節腫脹等一般情況，進行前后比較。

1.6.2? 足跖容積測量? 測量前，用防水不掉色黑色記號筆在大鼠后足踝關節處標好測量標線，為減少人為誤差，注意每次測量標線以及測足腫均由專人完成，并且每次標線的位置不宜有較大偏差，應在第1次測量時使用墨水針頭標記作為標線固點。將足跖容量測量儀放置水平固定的臺面上，進行校零，量杯中裝適中蒸餾水，測量時測量者先將大鼠一側后足抻直，放進裝有適量水的量杯中，直到后足的標線與量杯中液面平行，重復3次，再換下一側后足，記錄讀數，后取其平均數進行數據統計。在造模后第1、9天及以后每隔3 d進行1次足跖容積的測量。

1.6.3? HE染色? 備取已經固定好的膝關節滑膜組織，標定組號，流水清洗2 h，然后取出滑膜組織進行脫水，于56 ℃的石蠟浸泡進行包埋，包埋成塊后，將石蠟置于切片機中，切分成5 μm的石蠟片，石蠟片放入水浴鍋后展開貼在載玻片上進行烘干，60 ℃烘箱2 h。脫蠟后放入蘇木精溶液中染色5 min，接著使用蒸餾水沖洗，浸透于1%氨水中返藍，清水沖洗30～60 s后，于顯微鏡下觀察細胞核的分色程度，之后置于1%伊紅中染色，蒸餾水沖洗后脫水，最后每個組織滴加一點中性樹膠，蓋上蓋玻片。每個片子分別拍100×視野。

1.6.4? 免疫組織化學檢測? 備取已經固定好的膝關節滑膜組織，標定組號，流水清洗2 h，然后取出滑膜組織，依次浸透于不同濃度的乙醇、二甲苯中進行脫水，然后于56 ℃的石蠟浸泡進行包埋，包埋成塊后將石蠟置于切片機中，切分成5 μm的石蠟片，石蠟片放入水浴鍋后展開貼在載玻片上進行烘干，60 ℃烘箱2 h。脫蠟后放置于高壓噴氣中抗原修復，噴水致冷后將石蠟片放入10%羊血清中，室溫進行封閉1 h，去除封閉液后，滴加抗體，37 ℃孵育1 h后，PBS清洗5 min，4次。接著加相對應的二抗孵育，孵育后PBS搖洗5 min，10次。之后配備DAB顯色液，即配即用，顯微鏡觀察顯色，然后復染、脫水。每個切片上滴注些許中性樹膠后蓋上蓋玻片，每個片子分別拍400×視野。

1.6.5? Western blot檢測? 備取100 mg膝關節滑膜組織樣本，隨后加定量混有蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，攪勻混合溶液，使用勻漿機進行勻漿4 min，再將得到的樣品裂解30 min，裂解全程均在冰上操作，裂解完全后4 ℃、12 000 r/min離心20 min，利用BCA蛋白質定量法測定離心后得到的上清液蛋白質濃度，得到蛋白質樣品液。取蛋白質樣品液30 μg，加上一定蛋白質上樣緩沖液，放入恒溫槽中沸水浴10 min，再10 000 r/min離心10 min；隨之計算蛋白質分子量，來選擇制備10％或是12%的分離膠、濃縮膠，將之電泳，接著進行電轉，將膠上的蛋白質轉移至PVDF膜；下一步進行封閉，將PVDF膜全部浸泡于封閉液里，室溫25 ℃，孵育1 h后搖洗3次，每次10 min；而后分別加入VEGFR2、Cdc42蛋白的一抗，放入4 ℃冰箱過夜，隔天用PBST洗膜，每次20 min，搖洗3次后，使用移液槍吹打入相對應的二抗溶液，室溫25 ℃孵育1 h；隨之再用PBST搖洗3次，每次10 min，最后滴加顯影液，反應2 min后進行曝光顯影，得到條帶采用Image J軟件施行灰度分析，數據根據相對應的內參對比，以對照組進行歸一化處理，用于分析最終結果。

1.7? 統計學分析

采用SPSS 22.0對數據進行統計學處理。計量資料以“ｘ±s”表示，所有資料均進行正態性和方差齊性檢驗：符合正態分布者采用單因素方差分析；不符合正態分布者采用非參數檢驗。均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 一般情況

模型組大鼠活動及飲食減少，于造模后第3～5天尾根部出現脫皮紅腫，甚至出現潰爛，第9～12天后足、關節、耳朵、眼角陸續出現肉眼可見的紅腫，第15～18天癥狀達到高峰期。與空白組相比，其余3組體質量于造模后第1天差異均無統計學意義（P＞0.05）；模型組體質量于造模后第9天增長緩慢（P＜0.05），第15、21天增長明顯緩慢（P＜0.01）；西藥組、電針組體質量于造模后第9、15天差異無統計學意義，第21天增長明顯緩慢（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、電針組造模后第1、9天差異無統計學意義（P＞0.05），造模后第15天增長明顯緩慢（P＜0.01）；西藥組造模后第21天差異無統計學意義（P＞0.05）；電針組造模后第21天增長明顯緩慢（P＜0.05）。詳見圖1A。

2.2? 各組大鼠足跖容積比較

與空白組相比，其余3組足跖容積于造模后第1、9天差異均無統計學意義（P＞0.05）；模型組在第15、21天足跖容積均明顯增大（P＜0.01），提示模型制備成功；電針組與西藥組第15、21天均明顯增大（P＜0.05）。與模型組相比，其余3組于造模后第1、9天差異均無統計學意義（P＞0.05）；西藥組足跖容積在第15、21天均顯著減小（P＜0.01）；電針組在第21天明顯減小（P＜0.01）。詳見圖1B。

2.3? 各組大鼠滑膜組織病理結果的比較

空白組大鼠膝關節滑膜組織內襯層細胞排列規則（圖2箭頭①），未見炎性細胞浸潤。與空白組相比，模型組大鼠滑膜組織結構呈現異常，滑膜組織出現一定增生，膠原纖維組織可見大面積增生（圖2箭頭②）、諸多炎性細胞浸潤（圖2箭頭③）、大量血管增生（圖2箭頭④）。與模型組相比，電針組和西藥組大鼠滑膜結構較好，細胞密度明顯降低，一定程度緩解滑膜增生，出現較小面積的膠原纖維組織增生，炎性細胞浸潤較模型組少，偶見血管生成。

2.4? 各組大鼠滑膜組織中VEGFR2、CD34表達水平比較

空白組大鼠滑膜組織顯見極少量VEGFR2表達，與空白組相比，模型組大鼠VEGFR2表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，西藥組和電針組VEGFR2蛋白表達量減少（P＜0.01）?？瞻捉M大鼠滑膜組織見少量CD34蛋白表達，與空白組滑膜組織相比，模型組CD34表達明顯增加（P＜0.01），表明血管生成增加；與模型組相比，西藥組和電針組CD34蛋白表達明顯減少（P＜0.01）。詳見圖3。

2.5? 各組大鼠滑膜組織中VEGFR2、Cdc42蛋白表達水平比較

與空白組相比，模型組大鼠滑膜組織中VEGFR2、Cdc42蛋白表達量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、電針組VEGFR2、Cdc42蛋白表達量均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖4。

3 討論

RA在中醫學中屬于“痹病”范疇，多由“正氣不足，復感外邪”，內外相合發病。虛實夾雜、本虛標實為其病機特點，臨床多采用扶正祛邪、標本兼治的治療原則。針灸治療RA歷史悠久，具有扶正祛邪、通經活絡等功效[12-13]。針灸治療痹病一般情況下配方選穴以炎癥累及部位的局部選穴為主，同時配以遠部取穴[14]。局部選穴多選疼痛劇烈處，即“阿是穴”，能通經活絡、消腫止痛；遠部取穴多選用“足三里”“關元”等培正固元、補益氣血的穴位。故本研究選用電針“足三里”“關元”和“阿是穴”干預AA模型大鼠。

本實驗研究結果顯示，相比于空白組，模型組大鼠足跖容積在第15、21天顯著增加（P＜0.01），電針干預后第21天明顯減?。≒＜0.01），這與既往研究[6-7]一致。組織形態學結果顯示，模型組大鼠滑膜組織結構排列異常，炎性細胞浸潤明顯，血管生成增多，電針干預后滑膜組織結構較好，炎性細胞浸潤、血管生成明顯減少。CD34為血管特異性標志物[15]，免疫組化結果顯示與空白組比較，模型組表達明顯增加（P＜0.01），電針干預后CD34表達明顯下降（P＜0.01），提示電針干預后RA滑膜血管數量減少。因此，初步證實電針可有效抑制RA滑膜組織血管新生。另外，Western blot結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠關節滑膜組織中VEGFR2、Cdc42表達均明顯增多（P＜0.01），電針干預后，電針組VEGFR2、Cdc42表達量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），VEGFR2的免疫組化結果也佐證了這種趨勢，這提示VEGFR2/Cdc42信號通路可能在這一過程中發揮了重要的作用。

血管新生是RA病程中侵蝕骨與軟骨的重要病理基礎，是促進滑膜增生和炎癥發展的早期核心病理事件[16-17]。內皮細胞（endothelial cell， EC）遷移是滑膜血管新生的重要環節，偽足生成在細胞遷移中占有重要位置[18-19]，因此，可以通過抑制偽足生成來抑制血管新生。偽足生成由多條復雜的信號傳導通路共同調控的，研究表明，VEGF可特異性作用在EC上，通過與EC 表面的VEGFR2結合，激活小鳥苷酸三磷酸（Rho GTP）酶，引發一系列的信號轉導，刺激EC偽足生成[20]。Rho GTP酶是調節EC遷移、形態發生的關鍵因子，是細胞骨架的中心調節者，可以調節偽足的形成，Cdc42是其關鍵成員之一[21-22]。VEGF與VEGFR2 結合后將胞外信號傳遞至胞內，引起VEGFR2細胞內結構域中的Tyr1214位點磷酸化并激活下游Rho GTP酶的成員Cdc42，Cdc42從不活躍的GDP結合態轉換到活躍的GTP結合態，活化的GTP結合態的Cdc42通過調控下游信號分子介導EC上絲狀偽足的動態變化，直接影響EC遷移方向，最終導致血管新生[23-25]。

CD34是公認的血管特異性標志物，標記的細胞是血管內皮細胞。本實驗以VEGFR2及其下游Cdc42為切入點展開研究，結合組織形態學結果及血管內皮細胞標記物CD34免疫組化結果，觀察到模型組大鼠滑膜組織中CD34較空白組表達明顯升高（P＜0.01），說明模型大鼠血管新生增多，電針干預后CD34表達降低（P＜0.01），提示血管新生較少。VEGFR2免疫組化結果也同樣符合這種趨勢，這表明VEGFR2可能是電針發揮抑制血管新生的關鍵信號途徑。同時，本研究Western blot結果顯示，模型組大鼠滑膜組織中VEGFR2、Cdc42較空白組大鼠表達均明顯增多（P＜0.01），電針干預后VEGFR2、Cdc42蛋白表達量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），提示電針可能通過抑制VEGFR2的表達，從而下調Cdc42的活性，抑制血管新生，減少血管翳浸潤，減輕關節腫脹。因此，這提示電針抑制AA模型大鼠滑膜血管新生可能是由VEGFR2/Cdc42信號通路所介導。

綜上所述，電針治療RA的效應機制可能是通過抑制VEGFR2/Cdc42信號通路，抑制內皮細胞偽足生成及其遷移，從而抑制RA血管新生，改善關節癥狀，為電針抑制RA血管新生提供了一定的證據支持。為了更進一步確定VEGFR2/Cdc42信號通路在電針抑制RA血管新生的作用機制，后續將通過設置其信號通路關鍵蛋白的阻斷劑或激動劑展開研究，同時補充內皮細胞偽足生成直接證據的檢測。

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（本文編輯? 匡靜之）