患有壞死性小腸結腸炎的早產兒腸道菌群分析

王英豪，戴立英

1 蘇州大學附屬第二醫院兒科，江蘇蘇州 215008；2 安徽省兒童醫院新生兒科

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒期最常見的胃腸道急癥，主要見于早產兒，極低出生體質量（＜1 500 g）早產兒中發病率5%～10%［1］。NEC的病死率高達20%～30%［2-3］。NEC主要表現為不同程度腸壞死，以缺血性腸壞死為主要病理特征，治療不及時可并發腸外營養相關的膽汁淤積和肝功能障礙、營養不良、代謝性骨病、短腸綜合征、膿毒癥、嚴重感染和神經認知障礙［4］。目前，NEC的確切病因仍未完全了解，研究普遍認為NEC的發病可能是多因素導致的，可能包括細菌定植異常、免疫不成熟、腸屏障功能不成熟、微血管發育不全等。健康的腸道環境可以有助于早產兒減少腸道炎癥和損傷。異常定植的細菌可導致早產兒腸道微生物群落紊亂。NEC早產兒的腸道菌群多樣性是否與正常新生兒不同，目前相關研究較少。為此，我們對患有NEC 早產兒的腸道菌群結構進行分析，旨在為后續NEC的診療提供理論依據。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年1 月—7 月安徽省兒童醫院收治的早產兒66 例，發生NEC 44 例（觀察組，其中觀察1 組22 例、觀察2 組22 例）、未發生NEC 22例（對照組）。觀察組納入標準：①符合NEC臨床診斷標準，Ⅰ期為“可疑”期，X 線片以胃潴留和輕度腹脹為特征；Ⅱ期為“腸梗阻”期，主要表現為腸梗阻、水腫、腸壁積氣征等；Ⅲ期為疾病的晚期，進展迅速惡化，易發生腸壞死、膿毒性休克、消化道出血，穿孔等嚴重并發癥；②明確診斷NEC Ⅱ或Ⅲ度的早產兒；③標本收集前后均不使用免疫制劑及微生物制劑。排除標準：排除腸閉鎖、巨結腸等腸道發育畸形患兒。對照組納入標準：①同期在安徽省兒童醫院住院的早產兒；②對照組的日齡、胎齡、出生體質量、喂養方式、出生方式等臨床特征與NEC 組基本匹配，避免引起潛在NEC 及菌群失調的因素；③標本收集前后均不使用免疫制劑及微生態制劑。排除標準：排除腸閉鎖、巨結腸等腸道發育畸形患兒。觀察組中男10 例、女12 例，出生胎齡（35 ± 2）周，出生體質量（2 274 ± 236）g；剖宮產率41%（9/22），母乳喂養率36%（8/22）；對照組中男10例、女12例，出生胎齡（35 ± 3）周，出生體質量（2 358 ± 227）g，剖宮產率41%（9/22），母乳喂養率36%（8/22）。 本研究已通過安徽省兒童醫院倫理委員會批準（EYLL-2017-023），并獲得患兒父母或監護人書面知情同意。觀察組采取禁食、抗感染、維持內環境穩定、支持治療等綜合管理；對照組針對原發病進行對癥治療、抗感染、維持內環境穩定、支持治療等綜合管理。

1.2 三組患兒腸道菌群檢測 觀察1 組在診斷NEC 24 h 內、對照組于入院24 h 內收集糞便標本，觀察2 組在治療后（NEC 臨床癥狀明顯好轉，全量喂養時）采用一次性無菌糞便采集管從患兒尿布上收集糞便標本。采用16S rRNA 基因高通量測序技術檢測三組患兒糞便腸道菌群DNA，明確腸道菌群種類，測算三組腸道菌群多樣性指數（Shannon 指數、Sobs 指數、Simpson 指數及Chao 值）。① 糞便DNA提取：糞便DNA 的提取采用試劑盒的方法，所用試劑盒為德國QIAGEN 公司生產的QIAamp Stool Mini Kit。完成基因組DNA 提取后，采用1%瓊脂凝膠電泳檢測抽取的基因組DNA。② PCR 擴增：指定測序區域，合成含有barcode 的特異引物。用于16S rRNA V3 區 PCR 擴增的引物：338F：（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），806R：（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。③ Miseq 測序及生物信息分析：Miseq 測序得到的PE reads 首先根據overlap 關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區分樣本后進行OUT 聚類分析和物種分類學分析，基于OUT 聚類分析結果，可以對OUT 進行多種多樣性指數分析以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，利用Circos 軟件測算每組樣本的物種組成比例。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據處理。正態分布計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以%表示，組間或細菌種屬者統計學差異采用Mann-Whitney 檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組患兒腸道菌群類型比較 觀察1 組和對照組共有63 種菌群種類，獨有菌群種類分別為27、23 種。觀察2 組和對照組共有67 種相同菌群種類，獨有菌群種類分別為23、23 種。觀察1 組患兒腸道菌群的優勢菌群主要為腸球菌（40%）、厚壁菌門（21%）、變形菌門（23%）、雙歧桿菌（10%）；觀察2 組患兒腸道菌群的優勢菌群主要為大腸桿菌（28%）、腸球菌（21%）、雙歧桿菌（28%）、厚壁菌門（8%）、變形菌門（5%）；對照組腸道菌群的優勢菌群主要為大腸桿菌（42%）、腸球菌（25%）、雙歧桿菌（30%）、厚壁菌門（2%）。觀察1 組與對照組患兒腸道菌群種類構成比較，P＜0.05；觀察1 組與觀察2 組患兒腸道菌群種類構成比較，P＜0.05。

2.2 三組患兒腸道菌群多樣性比較 觀察1 組、觀察2 組及對照組患兒腸道菌群Shannon 指數分別為0.93 ± 0.50、0.91 ± 0.51、1.10 ± 0.34；Sobs 指數分別為19.36 ± 7.08、21.23 ± 6.43、21.96 ± 4.76；Simpson 指數分別為0.51 ± 0.26、21.23 ± 6.43、0.46 ± 0.16；Chao 值分別為22.16 ± 7.62、24.25 ±7.10、25.44 ± 6.97。三組腸道菌群多樣性指數間比較，P均＞0.05。

3 討論

NEC 是一種危及生命的消化系統疾病，常發生于早產兒，以腸缺血壞死為特征，除了發病率和病死率較高，腸狹窄粘連、膽汁淤積、短腸綜合征、發育不良和神經發育遲緩等長期并發癥發病率較高。腸道微生物群落擁有數千種細菌，它們在維持體內微生物平衡方面起著至關重要的作用，NEC 作為一種典型的腸道感染性疾病，腸道微生物菌群失調參與NEC 的發病機制［5］。PATEL 等［6］研究表明正常菌群可在上皮細胞表面的生長繁殖形成生物屏障，優先占領生存空間，抑制外來致病菌的定植，當腸道菌群正常的定植過程遭到破壞或延遲，將導致菌群結果發生改變，使正常菌群與宿主間的生態平衡失調，一些正常菌群成為機會致病菌，觸發炎癥反應，導致NEC的發生。

雖然腸道微生物菌群對NEC 的發展至關重要，但它們在其發病機制中的確切作用仍不清楚［7］。在過去的幾十年里，高通量測序已經成為評估糞便和其他人體基質中微生物群落的一種非常流行的方法［8］，最常見的是通過對細菌16S rRNA 基因進行測序，使研究人員能夠獲得腸道內微生物多樣性信息，以幫助識別與疾病相關的微生物組變化。在本研究中我們使用高通量測序技術，針對16S rRNA 基因的v3～v5 區發現觀察組治療前后和對照組菌群豐度無明顯差異，且NEC 組和對照組之間的Shannon 指數和Chao1 指數沒有顯著差異，表明菌群多樣性的缺乏并非NEC 發生的關鍵因素，與DOLLINGS 等［9］研究一致。同時通過本研究測序結果發現觀察組治療前后和對照組菌群種類存在顯著差異，其中觀察組（治療前）以腸球菌、厚壁菌門、變形菌門為主，而觀察組（治療后）和對照組以腸球菌、雙歧桿菌為主，提示厚壁菌門及變形菌門優勢，且雙歧桿菌減少可能導致NEC發生。 LINDBERG 等［4］對5例NEC患兒和5 例匹配對照患兒糞便樣本進行16S rRNA 基因測序分析，發現NEC 患兒中變形桿菌豐度較高，雙歧桿菌豐富較低，與本研究一致。STEWART 等［10］采用16S rRNA 基因測序技術對13 例NEC 患兒術后切除腸段和16 例自發性穿孔術后切除腸段對比研究發現，NEC 患兒切除腸段中變形桿菌及厚壁菌門相對豐度較高，且微生物多樣性較低。有研究表明胎齡越小NEC 發病率越高［11］，確診時的中位胎齡往往隨著胎齡的增加而減少，提示在發育中的腸道中，微生物定植和微生物識別受體的表達水平之間的聯合作用可能對NEC 的發生很重要。在對動物模型和手術切除的早產兒腸道研究表明，變形桿菌在腸道中通過識別G-脂多糖并激活TLR-4 后，可通過誘導微生物相關分子模式（microbe-associated molecular patterns， MAMPs）激活特定的TLRs，開啟特異性免疫反應，通過激活轉錄因子NF-κβ 啟動炎癥級聯反應，反過來引起腸上皮細胞凋亡和炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF-α）過度釋放，更容易引起細胞因子介導的腸系膜血管炎癥，破壞腸道免疫功能，造成腸組織局部缺血壞死，被認為是NEC發病的關鍵［12-13］。

本研究中經治療后的NEC 患兒和非NEC 患兒雙歧桿菌豐度較高，提示雙歧桿菌豐度較高的早產兒不容易發生NEC［14-15］。腸道微生態失調作為NEC發展的高危因素，使得益生菌作為單菌株或多菌株活微生物補充劑在早產和足月新生兒中進行了大量研究，其中以雙歧桿菌和乳酸桿菌是最為常見。LUESCHOW 等［16］一項對小鼠NEC 模型研究表明雙歧桿菌可通過減少炎癥細胞因子釋放，降低腸上皮細胞通透性和增強腸上皮細胞中的緊密連接，改善腸道上皮屏障來預防NEC 的發生。另外一項動物觀察表明在妊娠和哺乳期間，小鼠通過母體給予嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌可促進腸道發育，改善腸道屏障功能，減少斷奶前炎癥反應［17］。李忠堂等［18］以87 例NEC 早產兒為研究對象，分析其病原體特點，觀察不同治療方法對患兒血清炎癥因子的影響，并通過Logistic 回歸分析影響NEC 患兒預后的危險因素，發現雙歧桿菌干預可顯著降低NEC 早產兒血清IL-1β、IL-10 水平及TLR-4 表達。楊小慶等［19］對220 例早產兒隨機接受雙歧桿菌補充研究指出，接受雙歧桿菌補充早產兒胃潴留、腹脹及NEC 發生率均較未補充早產兒低。HAGEN 等［20］一項多中心對照試驗發現出生后第一個月單獨給予雙歧桿菌的早產兒NEC發生率明顯降低。

綜上所述，NEC 患兒與正常早產兒的腸道菌群種類構成沒有差異。與正常早產兒比較，NEC 患兒腸道菌群厚壁菌門及變形菌門的豐度增加，雙歧桿菌豐度減少。腸道菌群多樣性可能不是NEC 發生發展的關鍵，補充外源性雙歧桿菌可能有效減少早產兒NEC的發生。