隱丹參酮調節AMPK/Nrf2信號通路治療小鼠非酒精性脂肪性肝病作用機制

趙夢溪,羅 斌,呂建瑞,王 寧

(西安交通大學第二附屬醫院,陜西 西安 710004)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種臨床常見的代謝性疾病,與代謝障礙、氧化應激密切相關,主要特征為脂肪過度蓄積于肝臟,肝細胞脂肪變性[1]。流行病學報道,近年來NAFLD的患病率顯著上升,當前在全球范圍內,NAFLD的患病率約為25%[2]。本病與長時間高脂高糖飲食密切相關,此外,還與體內胰島素受體對胰島素敏感性降低有關[3]。若NAFLD不加以控制,可逐漸進展至非酒精性脂肪性肝炎[4]。目前,NAFLD的治療以改變生活方式為基礎,臨床暫未發現具有顯著療效的藥物,多數藥物在改善肝臟脂質的同時給肝臟帶來一定的負擔,不適合長期使用,因此需要不斷探索新療法、開發新藥物[5-6]。絕大多數西藥是通過化學方法合成的藥物,是在現代工藝下合成的藥物;而中藥多來源于自然界中的植物、動物、礦石等,不良反應較少[7-8]。此外中醫對非酒精性脂肪肝有獨特見解,認為本病屬“肝癖”范疇,病位在肝,與脾、腎相關,病理因素為痰濕瘀聚于脅下所致,其中“瘀”又是核心之一[9]。丹參屬活血化瘀藥,具有祛瘀活血、養血安神的作用,丹參酮是中藥丹參的主要成分之一。既往研究表明,丹參酮具有保護肝臟的作用。本研究基于腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/核因子E2相關因子2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號通路,從氧化應激角度探究隱丹參酮對NAFLD的治療作用,以為臨床NAFLD的藥物治療提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:60只雄性6周齡C57BL/6小鼠清潔級,體重18～22 g,購于西安交通大學醫學部動物實驗中心[SCXK(陜)2020-001]。小鼠飼養于西安交通大學動物實驗中心,飼養于12 h/12 h光、暗交替環境,濕度50%～60%,溫度25 ℃,日常自由覓食。

1.1.2 實驗試劑:隱丹參酮(含量98%,批號35825-57-1,上海同田生物);谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)檢測試劑盒(批號C010-2-1、C009-2-1、A111-1-1、A110-1-1、A001-3-2、A003-1-2、A006-1-1,南京建成生物);HE染色試劑盒(批號ST2023,上海尚寶生物);ECL發光液(批號34578、賽默飛世爾);PVDF膜(0.45 μm)(批號IPFL00010,默克西格瑪奧德里奇公司);OCT包埋劑(批號4583,北京索萊寶);AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、Nrf2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號AHO1332、PA5-17831、PA5-88084、MA5-15738-D680,賽默飛世爾科技中國公司);二抗(批號HRPDS-0003,北京中杉金橋)。

1.1.3 實驗儀器:常規垂直電泳儀(型號Mini-PROTEAN,美國Bio-Rad);酶標儀(型號BIO-DL K3 Plus,上海素秋儀器);精密電子天平(型號WT20003,常州萬泰天平儀器);化學發光成像系統(型號Chemi Doc XRS+,美國Bio-Rad);組織石蠟包埋機(型號ES500,美國Them Fisher Scietific);石蠟切片機(型號HM 325,美國Them Fisher Scietific);冰凍切片機(型號EM FC7,德國徠卡)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模、分組與給藥:60只小鼠隨機分為正常組12只和造模組48只,造模時用普通飼料喂養正常組,造模組小鼠給予高脂飼料+5%的紅糖水日常飲用喂養,高脂飼料喂養8周后,正常組處死2只,造模組處死8只,通過肝臟HE染色和油紅O染色檢測造模結果,結果示本研究小鼠均造模成功。造模成功后,將造模組剩余的40只小鼠隨機分為模型組、隱丹參酮低劑量組、隱丹參酮中劑量組和隱丹參酮高劑量組,每組10只。治療時,正常組和模型組小鼠給予0.9%氯化鈉溶液1 ml/(kg·d)腹腔注射,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠分別給予隱丹參酮7.5、15、30 mg/(kg·d)腹腔注射,治療4周后,進行后續實驗。

1.2.2 取材:治療結束后,所有大鼠禁食不禁水12 h,次日取出小鼠稱重后麻醉,打開腹腔,心臟取血法收集小鼠血液,收集血液后將其置入冰塊中,以3000 r/min離心10 min取上清液,存放于-80 ℃冰箱中備用。收集血液后取出肝臟,其中左外側葉的肝臟保存于組織固定液中用于肝臟組織病理學觀察,其余肝臟組織放入超低溫冰箱中,備用于Western blot檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 小鼠肝臟組織和血清TG、TC檢測:稱取100 mg肝臟組織,將其用組織提取液提取后收集上清液,定量并調平,然后采用TG和TC檢測試劑盒檢測TG、TC水平;心臟取血,離心后取上清液,檢測血清TG、TC水平。

1.3.2 小鼠血清AST、ALT、MDA、SOD水平檢測:將血清從超低溫冰箱中取出,按照試劑盒說明書,依次檢測AST、ALT、MDA、SOD水平,然后依次計算其表達水平。

1.3.3 小鼠肝臟組織HE染色和油紅O染色:從組織固定液中取出肝臟組織,用超純水將其反復沖洗后,依次將其置入70%、80%、90%、95%、100%乙醇中浸潤并脫水,然后將其浸入二甲苯溶液中進行透明處理,最后采用石蠟包埋制作成石蠟塊。使用切片機將其切成3～5 mm薄片,切片脫蠟后,進行HE染色和油紅O染色,然后收集圖像在光學顯微鏡下觀察,每個切片選取4個不同的視野。

1.3.4 Western blot檢測Nrf2、AMPK、p-AMPK蛋白表達:稱取100 mg肝臟組織,將其用組織提取液提取后,收集上清液,定量并調平,然后采用SDS-PAGE垂直電泳將蛋白進行電泳分離,電泳條件為80 V恒壓電泳30 min,120 V恒壓電泳60 min,電泳完成后,將目的蛋白轉移到預先用甲醇浸泡過的PVDF膜上,轉膜完成后,將其取出用5%的脫脂牛奶封閉30 min,加入一抗過夜孵育,次日取出,加入二抗孵育30 min,最后采用ECL發光液進行反應,凝膠成像儀收集圖像。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析。計數資料采用均數±標準差表示,兩組間比較采用Oneway ANOVA進行,多組間比較采用LSD 方法進行;P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況比較 正常組小鼠體毛光滑發白,反應靈敏,喂食時精神活躍,觀察墊料濕度平均;模型組小鼠有明顯的毛色發黃干枯,反應相對遲緩,同時墊料濕度高且明顯發臭;與模型組比較,隱丹參酮治療后,小鼠毛發、活動等均明顯改善,其中隱丹參酮高劑量組改善最為明顯。

2.2 各組小鼠AST、ALT水平比較 見表1。模型組相較于正常組小鼠血清AST、ALT水平均呈明顯升高趨勢(P<0.05);隱丹參酮各治療組相較于模型組小鼠AST、ALT水平均明顯降低(P<0.05);隱丹參酮高劑量組與正常組小鼠ALT、AST水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠肝臟、血清TG及TC水平比較 見表2。與正常組比較,模型組小鼠血清及肝臟組織TG、TC水平均呈顯著升高趨勢(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠肝臟和血清組織TG、TC水平均呈明顯降低趨勢(P<0.05)。

2.4 各組小鼠MDA、SOD、GSH水平比較 見表3。與正常組比較,模型組小鼠血清MDA水平明顯升高,SOD、GSH水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠MDA水平明顯降低,SOD、GSH水平明顯升高(P<0.05);隱丹參酮高劑量組與正常組小鼠MDA、SOD、GSH水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠MDA、SOD、GSH水平比較

2.5 各組小鼠肝臟組織病理學改變 肝臟組織病理學HE染色可見,正常組小鼠肝臟組織細胞結構完整,細胞核分布于細胞中間,細胞也未見明顯的脂肪空泡;模型組小鼠有明顯的肝臟脂肪變性,大量彌漫性的脂肪空泡聚集;與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠肝臟組織空泡數量明顯減少。肝臟組織油紅O染色可見,正常組小鼠切片未見紅色脂滴;模型組小鼠則表現有大量的脂滴;與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠紅色脂滴數量明顯降低,尤其是隱丹參酮高劑量組紅色脂滴數量與正常組相近。見圖1。

2.6 各組小鼠AMPK/Nrf2信號通路相關蛋白表達比較 與正常組比較,模型組小鼠Nrf2蛋白表達明顯降低(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠Nrf2表達明顯升高(P<0.05)。隱丹參酮低、中、高劑量組與模型組小鼠AMPK蛋白表達比較,差異無統計學意義(P>0.05);與正常組比較,模型組小鼠p-AMPK蛋白表達明顯降低(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠p-AMPK表達明顯升高(P<0.05)。見表4(圖2)。

A:正常組;B:模型組;C:隱丹參酮低劑量組;D:隱丹參酮中劑量組;E:隱丹參酮高劑量組

表4 各組小鼠AMPK/Nrf2信號通路相關蛋白表達比較

3 討 論

本實驗通過高脂高糖飲食構建NAFLD動物模型。本造模相對于其他造模方法,造模時間稍長,病變程度較輕,但其簡便易行,且造模成功率高,所構建的NAFLD動物模型與臨床NAFLD患者的病理特征相似[10-11]。因此本研究采用高脂高糖飲食構建NAFLD小鼠模型,小鼠肝臟組織病理學觀察顯示,正常組沒有任何脂肪空泡,而模型組則出現大量的彌漫性脂肪空泡,這與文獻報道結果相符,說明采用高脂高糖飲食8周能夠構建NAFLD小鼠模型。該種造模與中醫飲食不節、情志失調等因素相關,由于小鼠長期的飲食不節,過食肥甘厚味,導致脾失健運,水濕內停,聚而為痰;加上長期關于鼠籠情志失調,肝氣郁滯,導致氣滯血瘀,日久痰瘀互結為病[12-14]。

NAFLD的首要病理因素為痰瘀,治療以活血化瘀為治療總綱。諸多醫家在使用活血化瘀方劑治療NAFLD時,丹參使用頻率較高且多作為君藥。隱丹參酮是從丹參酮中分離得到的一種具有藥理活性的單體化合物[15-16]。研究顯示,隱丹參酮具有較高的藥理活性,其具有抗癌、抗氧化、抗衰老作用,對部分腫瘤、冠心病、心絞痛、心肌損害有一定療效;隱丹參酮可通過抑制基質金屬蛋白酶的表達,抑制活性氧的產生和激活NF-κB,此外其對肝臟也具有一定的保護作用[17-18]。但是尚無相關研究將隱丹參酮用于NAFLD的治療,基于此本研究探討隱丹參酮治療NAFLD的作用機制。NAFLD最顯著的病理特征為肝功能和血脂指標的異常以及抗氧化應激能力的降低[19-20]。為此本研究觀察了氧化應激指標、肝功能和血脂指標的變化特點,研究結果顯示高脂高糖飲食喂食小鼠后,小鼠血清和肝臟組織TG、TC水平明顯升高,肝功能AST、ALT水平也明顯升高,同時氧化應激指標MDA水平明顯升高,而抗氧化應激指標SOD、GSH水平則明顯降低,這進一步證實了高脂高糖飲食8周確實可以構建NAFLD模型[21]。采用不同劑量隱丹參酮治療后,小鼠肝功能指標AST和ALT、血清和肝臟TG、TC及氧化應激指標MDA則明顯降低,與模型組比較,抗氧化應激指標SOD和GSH水平明顯升高,以上研究結果證實隱丹參酮對NAFLD有一定的治療作用。

AMPK/Nrf2信號通路是近年來研究較多的信號通路,目前研究已經證實在NAFLD發生和發展過程中,AMPK/Nrf2信號通路參與了NAFLD脂肪蓄積、炎癥反應以及氧化應激等多條信號軸,通過調控AMPK/Nrf2信號通路能夠較好地實現對NAFLD的治療[22-23]。AMPK可表達于機體的任何器官中,能被包括細胞壓力、運動以及激素等影響細胞代謝的物質所激活,進而參與炎癥與氧化應激反應,維持葡萄糖代謝的平衡[24-25]。而Nrf2主要參與氧化應激反應,Nrf2能夠通過上調其自身的表達,進而減少氧化應激相關指標的生成,維持機體氧化/抗氧化平衡[26-27]。Nrf2與AMPK相互協調共同促進了NAFLD的發生與發展[28-29]。本研究結果發現,采用隱丹參酮治療后,與正常組比較,模型組小鼠Nrf2蛋白表達明顯降低;與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠Nrf2表達明顯升高。模型組小鼠p-AMPK蛋白表達相較于正常組明顯降低;相較于模型組,隱丹參酮各治療組小鼠p-AMPK表達顯著升高。以上研究結果證實隱丹參酮對AMPK/Nrf2信號通路具有明顯的調節作用,進而發揮保護肝臟作用。

綜上所述,隱丹參酮可能通過調節AMPK/Nrf2信號通路,提高抗氧化能力,減少肝臟脂質蓄積發揮肝臟保護作用。