保腎通絡(luò)方含藥血清對高糖培養(yǎng)足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

崔方強(qiáng),王悅芬,孟 元,蔡 朕,江心燦,趙文景

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是臨床常見疾病,是導(dǎo)致終末期腎臟病(End stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。蛋白尿是DN的典型臨床表現(xiàn),同時也是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵病理因素。高糖介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷在DN蛋白尿的產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用[2]。足細(xì)胞損傷表現(xiàn)為足細(xì)胞相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)功能異常及足細(xì)胞凋亡[3]。腎病蛋白(Nephrin)是足細(xì)胞重要功能蛋白,結(jié)蛋白(Desmin)是足細(xì)胞損傷的標(biāo)志蛋白[4]。高糖可以引起足細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致濾過屏障破壞及蛋白尿[5]。保腎通絡(luò)方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科臨床協(xié)定處方,被廣泛用于DN的臨床防治,取得較好的臨床療效。但是保腎通絡(luò)方對于高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞Nephrin蛋白、Desmin蛋白及足細(xì)胞凋亡的作用目前尚不清楚。因此,本研究探討保腎通絡(luò)方含藥血清對于高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:10只雄性SD大鼠,平均體重(200±20)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004。大鼠在12 h光照/黑暗循環(huán)、溫度(24±1)℃、濕度50%～70%條件下飼養(yǎng),并可自由進(jìn)食進(jìn)水。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守動物福利倫理原則。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:條件永生小鼠足細(xì)胞系,購于北納生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和藥物:CCK-8試劑盒(批號C40042,碧云天生物),胱天蛋白酶3(Caspase-3)抗體(批號ab13847,Abcam),Nephrin抗體(批號ab216341,Abcam),Desmin抗體(批號ab32362,Abcam),Hochest33258染料(批號C0021,Solarbio),FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(批號KGAA25,凱基生物);保腎通絡(luò)方顆粒劑由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器:酶標(biāo)儀(型號ZS-3,北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司),離心機(jī)(型號3K18,美國Sigma),倒置顯微鏡(型號DMIL-PH1,德國Leica),凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(型號FUSION FX6 XT,法國Vilbe),激光共聚焦顯微鏡(型號TCS SP8 STED,德國Leica)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 保腎通絡(luò)方含藥血清制備:將SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、保腎通絡(luò)方含藥血清組,每組5只。各組大鼠均自由飲食及飲水。保腎通絡(luò)方含藥血清組大鼠灌服保腎通絡(luò)方1.0 g/ml(以生藥量計(jì)算濃度),2 ml/次,2次/d,空白對照組灌服等量蒸餾水,連續(xù)灌胃3 d,血藥濃度達(dá)峰值時,麻醉后開腹取血。分離血清后56 ℃水浴30 min,無菌濾器過濾除菌,-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)胞分組及給藥:在DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)條件永生小鼠足細(xì)胞系,待細(xì)胞生長至80%融合時,將足細(xì)胞分為正常對照組、模型組和保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組。正常對照組足細(xì)胞予DMEM低糖培養(yǎng)基、24.5 mmol/L甘露醇和空白血清培養(yǎng),模型組足細(xì)胞予DMEM高糖培養(yǎng)基和空白血清培養(yǎng),保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組在予DMEM高糖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別予5%、10%、15%保腎通絡(luò)方含藥血清培養(yǎng)。各組足細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,對細(xì)胞進(jìn)行固定或者收集,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8檢測足細(xì)胞活性:將消化好的足細(xì)胞懸液移入96孔板,保證每孔足細(xì)胞數(shù)目一致,并且細(xì)胞數(shù)目不少于1×104個。待細(xì)胞貼壁并生長狀態(tài)良好時,對不同組別足細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。然后每孔加入10 μl的CCK-8溶液,孵育后用酶標(biāo)儀檢測各孔OD值,并根據(jù)OD值檢測各組足細(xì)胞活性。細(xì)胞活性(%)=加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD×100%。

1.2.4 免疫熒光檢測足細(xì)胞蛋白表達(dá):將消化好的足細(xì)胞懸液移入12孔板,每孔細(xì)胞數(shù)目一致。待細(xì)胞80%融合且生長狀態(tài)良好,予不同干預(yù)措施。然后4%多聚甲醛固定,透膜后,予一抗4 ℃孵育過夜,后予二抗37 ℃孵育2 h,DAPI染核后封片。共聚焦顯微鏡觀察各組足細(xì)胞Nephrin、Desmin、Caspase-3蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 RT-PCR檢測Nephrin、Desmin mRNA表達(dá):提取各組足細(xì)胞總RNA,將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR儀對其進(jìn)行擴(kuò)增和熒光定量,采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析,實(shí)驗(yàn)操作完全按照說明書操作步驟進(jìn)行。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,引物序列如下。Nephrin上游引物:5’-AATTGGCGGCTGGGTCTTAGGG-3’,下游引物:5’-AGGCGTGTGGGCGTGTATATGT-3’;Desmin上游引物:5’-AGACCTTCTCTGCTCTCAACTTCC-3’,下游引物:5’-CTCGCTGACAACCTCTCCATCC-3’。

1.2.6 Hochest33258染色檢測足細(xì)胞凋亡:將消化好的足細(xì)胞懸液移入12孔板,每孔細(xì)胞數(shù)目一致。待細(xì)胞80%融合并生長狀態(tài)良好后,予不同干預(yù)措施。4%多聚甲醛固定足細(xì)胞30 min,透膜后用Hochest33258染液染核30 min,甘油封片。共聚焦顯微鏡觀察各組足細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組足細(xì)胞的細(xì)胞活性比較 見表1。與正常對照組比較,模型組足細(xì)胞的細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05);與模型組比較,保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組足細(xì)胞的細(xì)胞活性不同程度升高(均P<0.05)。

表1 各組足細(xì)胞的細(xì)胞活性比較(%)

2.2 各組足細(xì)胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 見表2(圖1)。與正常對照組比較,模型組足細(xì)胞Nephrin蛋白表達(dá)明顯降低,Desmi、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組足細(xì)胞Nephrin蛋白表達(dá)明顯升高,Desmi、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。

圖1 各組足細(xì)胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表達(dá)(免疫熒光染色,×400)

表2 各組足細(xì)胞Nephrin、Desmi、Caspase-3蛋白表達(dá)比較

2.3 各組足細(xì)胞Nephrin、Desmi mRNA表達(dá)比較 見表3。與正常對照組比較,模型組足細(xì)胞Nephrin mRNA表達(dá)顯著降低,Desmin mRNA表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05);與模型組比較,保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組足細(xì)胞Nephrin mRNA表達(dá)顯著升高,Desmin mRNA表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)。

表3 各組足細(xì)胞Nephrin、Desmi mRNA表達(dá)比較

2.4 各組足細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目比較 見表4(圖2)。與正常對照組比較,模型組足細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯升高(P<0.05);與模型組比較,保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組足細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少(均P<0.05)。

表4 各組足細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目比較(個)

3 討 論

DN是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致ESRD重要的原發(fā)腎臟疾病[6]。與其他腎臟疾病比較,DN具有病情進(jìn)展迅速的特點(diǎn)。蛋白尿是導(dǎo)致DN進(jìn)展的關(guān)鍵病理因素[7]。腎小球?yàn)V過膜(Glomerular filtration barrier,GFB)是維持腎小球?yàn)V過功能和阻止蛋白尿產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。GFB由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、足細(xì)胞三層結(jié)構(gòu)組成,而足細(xì)胞是GFB中最為關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)[8]。足細(xì)胞又稱為腎小球上皮細(xì)胞,其包裹在基底膜外側(cè),組成腎小球?yàn)V過膜最為重要的屏障[9-11]。高糖介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷是DN蛋白尿產(chǎn)生及疾病進(jìn)展的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。減輕足細(xì)胞損傷可有效改善DN蛋白尿,延緩疾病進(jìn)展[12]。

DN足細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為功能蛋白表達(dá)異常及足細(xì)胞凋亡。在DN中,高糖刺激會引起足細(xì)胞功能蛋白Nephrin表達(dá)下調(diào),損傷蛋白Desmin表達(dá)上調(diào),最終介導(dǎo)足細(xì)胞損傷[13-14]。Nephrin蛋白是足細(xì)胞特有的標(biāo)志蛋白,同時也是非常重要的功能蛋白。Nephrin蛋白是一種跨膜蛋白,其胞外域分布在裂孔隔膜,并與相鄰足細(xì)胞的Nephrin蛋白相互交叉,在裂孔隔膜上組成特殊的拉鏈狀結(jié)構(gòu)。這種特殊的拉鏈狀結(jié)構(gòu)在維持腎小球?yàn)V過功能方面起著至關(guān)重要的作用。此外,Nephrin蛋白能夠介導(dǎo)足細(xì)胞系列信號傳導(dǎo),并能維持足細(xì)胞正常的細(xì)胞骨架[15]。Desmin蛋白是細(xì)胞骨架的中間絲蛋白,在正常足細(xì)胞中不表達(dá)。而在足細(xì)胞損傷時,足細(xì)胞出現(xiàn)表型改變,并發(fā)生骨架重排。此時足細(xì)胞開始表達(dá)Desmin蛋白,并且其表達(dá)與足細(xì)胞損傷水平呈正相關(guān)[16]。因此,Desmin蛋白是足細(xì)胞損傷的標(biāo)志蛋白。

DN患者中腎小球足細(xì)胞數(shù)量明顯減少[17]。高糖可介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,而足細(xì)胞凋亡會引起足細(xì)胞從腎小球基底膜上脫落,使足細(xì)胞數(shù)量及密度減少。足細(xì)胞是一種終末分化期細(xì)胞,失去了再生修復(fù)的能力。因此,足細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)量減少最為主要的原因[18-20]。足細(xì)胞凋亡病理機(jī)制十分復(fù)雜,涉及不同信號通路,其中Caspase-3蛋白是介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[21]。Caspase-3位于細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的中心位置,活化后直接參與切割細(xì)胞多種結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞以凋亡的形式解體,是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶[22]。

中醫(yī)藥防治DN具有獨(dú)特的優(yōu)勢,并顯示出多靶點(diǎn)效應(yīng)[23]。DN屬于中醫(yī)“水腫”“尿濁”“關(guān)格”等范疇,不同醫(yī)家對其病因病機(jī)有不同的闡述。呂仁和等[24]認(rèn)為DN的主要病機(jī)為痰濁瘀血積聚于腎絡(luò),而形成癥瘕,因此提出了微型癥瘕的病機(jī)理論。南征教授認(rèn)為,DN后期出現(xiàn)的痰濁、瘀血、水濕等病理產(chǎn)物都屬于內(nèi)生之毒,因此提出毒損腎絡(luò)的病機(jī)理論[25]。名中醫(yī)張炳厚認(rèn)為DN初期多為氣陰兩虛、陰虛燥熱,繼而出現(xiàn)氣血凝滯,絡(luò)脈閉阻,日久耗傷腎之精氣,導(dǎo)致腎失封藏,精微下泄,因此提出“腎氣精兩虛,腎失封藏,腎絡(luò)閉阻”是DN的核心病機(jī),并提出補(bǔ)腎活血通絡(luò)的治療原則。保腎通絡(luò)方即在上述治法指導(dǎo)下組方而成,由黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭、丹參等藥物組成。全方在補(bǔ)腎益氣藥物基礎(chǔ)上,加用蟲類藥物,共奏補(bǔ)腎活血通絡(luò)之功。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),保腎通絡(luò)方治療DN臨床療效甚佳[26]。但是,保腎通絡(luò)方防治DN的分子機(jī)制目前尚未闡明。

本實(shí)驗(yàn)觀察了保腎通絡(luò)方對高糖培養(yǎng)足細(xì)胞細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示,保腎通絡(luò)方含藥血清可提高高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞細(xì)胞活性,減輕足細(xì)胞損傷,呈劑量依賴性。鑒于Nephrin、Desmin蛋白表達(dá)失調(diào)及細(xì)胞凋亡在足細(xì)胞損傷中的重要作用,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察保腎通絡(luò)方含藥血清對于高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞Nephrin、Desmi表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,保腎通絡(luò)方可以上調(diào)高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞Nephrin蛋白及mRNA表達(dá),下調(diào)Desmin蛋白及mRNA表達(dá)。足細(xì)胞損傷早期表現(xiàn)為蛋白表達(dá)失調(diào),而到后期則會出現(xiàn)足細(xì)胞凋亡。因此,本實(shí)驗(yàn)對不同組別足細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)情況進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高糖刺激可以引起Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)及介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,保腎通絡(luò)方含藥血清可以明顯下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá),抑制足細(xì)胞凋亡。

綜上所述,保腎通絡(luò)方可以減輕DN足細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與其上調(diào)足細(xì)胞Nephrin蛋白、下調(diào)Desmin蛋白表達(dá),減輕足細(xì)胞凋亡有關(guān)。