探究菟絲子-枸杞子治療糖尿病性骨質疏松癥的作用機制*

馬桃梅，韓世杰，王晶，馬歡歡，王曉暉

1 甘肅中醫藥大學 甘肅蘭州 730000

2 甘肅省中醫醫院 甘肅蘭州 730050

隨著我國經濟水平的逐步提高，飲食結構的改變，人口老齡化的加劇以及遺傳等因素的影響，糖尿病發病率逐年升高且趨向于年輕化。2型糖尿病（T2DM）是一種常見的代謝性疾病，其主要特征是以胰島素作用障礙或分泌不足所引發的高血糖[1]，其作為全身性代謝紊亂疾病，不僅與三大物質代謝有關，而且與鈣、磷、鎂等礦物質代謝關系密切，從而產生腎病、視網膜病變、糖尿病足及骨骼系統疾病等100多種多系統并發癥[2]，其中2型糖尿病性骨質疏松癥（Diabetic osteoporosis，DOP）作為2型糖尿病在骨骼系統中最常見的慢性并發癥，國內外研究[3-5]均證實，2型糖尿病患者存在骨量丟失，2型糖尿病繼發骨質疏松發生率高達49.02%，主要臨床特點為腰背、髖部疼痛、持續肌肉疼痛，并伴有活動受限，早期無明顯的癥狀、體征，嚴重時行走困難，身長縮短，容易骨折，為患者生活帶來極大影響。

醫學古籍中尚無關于2型糖尿病性骨質疏松的記載，糖尿病在中醫學中歸屬于“消渴病”范疇，而骨質疏松癥根據其臨床表現應歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”“腰腿痛”等病癥[6]，目前尚無統一的中醫命名，不過多數醫家認為“骨痿”是比較準確的描述。糖尿病在中醫學中屬于“消渴”范疇，其基本病機是陰虛燥熱，病變臟腑涉及肺、胃、腎三臟，以腎為主，因此認為糖尿病性骨質疏松癥的病因病機是由于消渴陰虛內熱日久，耗氣傷腎，腎精虧虛，髓海不足，骨失所養，骨枯髓減，最終導致骨質枯槁發為“骨枯”“骨痿”等[7-8]。現代多數醫家也認為腎臟虛衰，髓海不足是糖尿病性骨質疏松癥的關鍵病機。菟絲子味甘、溫，歸腎、肝、脾經，具有滋補肝腎、固精縮尿、安胎、明目、 止瀉之功效[9]。枸杞子味甘，性平，歸肝、腎經，有滋肝補腎、益精明目的功效[10]。兩藥都入肝腎經，是臨床上補益肝腎、滋陰益髓的常用藥物，具有較好的療效。本文通過中藥網絡藥理學探究菟絲子-枸杞子藥對治療DOP可能潛在作用靶點和信號通路，為臨床開發新的方藥提供方向。

材料和方法

1 數據庫與軟件

見表1。

表1 數據庫與軟件

2 中藥活性成分及其作用靶點篩選

使用中藥系統藥理學數據庫及分析平臺（TCMSP） 以口服生物利用度（ OB） ≥30%、類藥性（DL）≥0.18進行菟絲子-枸杞子活性成分的篩選。

3 構建小分子化合物對應靶標數據庫

將1.步查詢到的小分子化合物依次作為關鍵詞放入相應藥物的 TCMSP 數據庫中查詢，設置查詢結果為 Targets Information，得到各個化合物對應靶標蛋白合并，并通過Uniprot數據庫轉換出作用靶點的通用基因名稱，建立中藥化學成分-靶點數據庫。

4 DOP疾病靶點的提取

使用糖尿病性骨質疏松癥的英文檢索術語（Diabetic osteoporosis）在Drug Bank、OMIM、PharmGkb數據庫查詢DOP相關靶點，剔除非人源基因，繪制疾病靶點交集基因venn圖。

5 中藥靶點與疾病相關基因韋恩（Venn）圖的繪制

利用R軟件進行中藥靶點與疾病相關基因韋恩（Venn）圖的繪制，圖中交集靶點即為菟絲子-枸杞子抗DOP的作用靶點。利用這些基因為橋梁構建中藥后續的調控網絡。

6 蛋白質-蛋白質相互作用 （PPI） 網絡的構建

將中藥靶點-疾病基因交集文件輸入到String數據庫中，將物種設定“Homo sapiens”、參數設置為0.9，獲得PPI的數據文件。隨后將此文件導入Cytoscape3.8.0軟件，獲得蛋白PPI網絡圖，根據PPI網絡圖中各靶點的點度中心性（degree）、中介中心性、接近中心性等拓撲學參數篩選出關鍵靶點。這些參數值越大說明此節點在網絡中越重要，選取數據排名靠前的核心靶點蛋白。

7 GO、KEGG分析

使用DAVID數據庫對中藥干預DOP靶點進行功能的富集分析，包括GO功能富集、京都基因與基因組百科全書通路富集（KEGG）分析，GO分析包括生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）的富集分析。

結 果

1 菟絲子-枸杞子活性成分及作用靶點

按照OB≥30%、DL≥0.18在TCMSP數據進行中藥活性成分的篩選，共得到56種，其中菟絲子11種、枸杞子45種（圖中僅列出符合OB、DL條件排名前10的成分，見表2）。同時，篩選出菟絲子-枸杞子藥對作用靶點共 705個。

2 DOP疾病相關基因及相關的菟絲子-枸杞子作用靶點

以糖尿病性骨質疏松癥的英文為檢索術語 （Diabetic osteoporosis）在Drug Bank、OMIM、PharmGkb數據庫查詢到3195個與DOP相關靶點，進行了三大數據庫疾病交集靶點圖的繪制（圖1）。然后進行了藥物靶點和疾病靶點韋恩圖的繪制獲得的交集基因共143個，

圖1 疾病靶點Venn圖

作為菟絲子-枸杞子治療DOP的潛在靶點進行后續分析（圖2）。

圖2 中藥-疾病交集靶點

3 “中藥-疾病-靶點”可視化網絡圖

利用 Cytoscape3.8.0軟件構建“藥物-疾病-靶點”網絡圖，共得到 185個節點，其中中藥治療 DOP有效成分節點42個，疾病與藥物交集靶點143個。圖中紫色圓圈代表菟絲子活性成分，紅色圓圈代表枸杞子活性成分，藍色方塊代表藥物干預疾病潛在靶點，連線代表著化合物與靶點之間相互作用關系（圖3）。

圖3 中藥-疾病-靶點網絡圖

4 PPI網絡圖構建

將藥物與疾病共有的143靶點上傳String數據庫獲取蛋白之間的作用關系，構建蛋白相互網絡（圖4），其中節點代表基因，連線代表蛋白互作關系，不同顏色代表不同證據。然后將網絡導入到 Cytoscape3.8.0軟件中利用 CytoNCA 插件進行計算網絡節點的度中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心性 （EC）、網絡中心性（NC）和局部邊連通性（LAC），得到上述值的中位數，小于中位數的靶點則去除。第一次分析得到核心基因網絡共包含了123個靶基因。第二次分析得到核心基因網絡共包含33個重要靶基因。 最終分析得到核心靶基因共12個（圖5）。表3為最終核心基因在各個參數的得分值。

圖4 PPI網絡圖

圖5 核心靶基因

表3 最終核心基因得分值

5 GO 和 KEGG 分析

在GO富集分析中共得到2427條，其中生物學進程 （ biological process，BP）2195條，細胞組分（cellular component，CC） 77條，分子功能 （molecular function，MF） 155條，根據 P值從小到大篩選 BP、CC和 MF 排名前十繪制柱狀圖（圖6）和氣泡圖（圖7）。BP重要富集在細胞外刺激的反應、營養水平、氧化應激反應、氧活性（含量）反應等。CC 涉及最高的條目包括膜筏、膜微區、胞質囊腔等。MF 中富集最高的包括DNA-結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、脫氧核糖核酸結合性轉錄激活蛋白等。KEGG 通路富集分析共得到158個富集條目，選取前30個 進行分析顯示柱狀圖（圖8）和氣泡圖（圖9），其中脂質與動脈粥樣硬化、流體剪應力與動脈粥樣硬化糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路、癌癥相關信號通路、腫瘤壞死因子信號通路（TNF）、IL-17信號通路、肝炎相關信號通路等信號通路可能與菟絲子-枸杞子治療 DOP 機制密切相關。

圖6 GO分析的柱狀圖

圖7 GO分析的氣泡圖

圖8 KEGG通路分析的柱狀圖

圖9 KEGG通路分析的氣泡圖

討 論

2型糖尿病性骨質疏松癥發生發展的根本在于腎虛，涉及脾、肝，三臟之間相互影響，病理表現為精氣不足，骨髓空虛，骨質脆弱。菟絲子-枸杞子藥對是中醫臨床治療DOP的常用藥對，具有補腎填精、調節腎陰陽平衡的功效，是補腎益精類方劑中的常用藥對[11]。現代藥理學研究菟絲子具有免疫調節、改善心腦血管、保肝、降血糖、調節內分泌、營養神經、骨損傷修復等作用[12-13]。枸杞子具有降血糖、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂、抗脂肪肝等作用，大量臨床實踐也證明兩藥合用可以治療DOP。然而，菟絲子-枸杞子藥對治療DOP的潛在機制仍不清楚，因此，本文設計了網絡藥理學方法進一步探索藥對的藥理機制。

通過篩選得到菟絲子-枸杞子的活性成分共56種，其中β-谷甾醇，槲皮素、山柰酚、芝麻素等成份節點度值較高說明這些化合物在抗DOP中起重要的作用，其中β-谷甾醇是一種植物甾醇，現代藥理學發現其具有抗氧化、抗炎、鎮痛、降血糖、免疫調節等作用。王鵬等[14]通過細胞實驗證明槲皮素能顯著改善骨小梁結構數量，增加骨密度，對廢用性骨質疏松有明顯預防作用；其機制與槲皮素可抑制 ERK1/2、MAPK mRNA 和蛋白的表達，從而抑制 ERK1/2-MAPK 信號通路的傳導有關。劉軍等[15]通過補充槲皮素輔助雙膦酸鹽治療老年性骨質疏松患者臨床觀察，發現可以顯著改善患者骨密度指標、疼痛癥狀、功能障礙情況及骨代謝指標的異常表達，提升患者生活質量。王艷等[16]發現槲皮素可通過調節骨組織中OPG、RANKL的相對含量而抑制骨吸收，防止骨質疏松。現代藥理研究表明，山奈酚具有抗癌、抗炎、抗骨質疏松、降糖、免疫調節和修復損傷組織等作用[17]。曾意榮等[18]發現山柰酚能夠激活雌激素受體的活性，促進成骨細胞增殖，提高成骨細胞分化和礦化能力。馬忠平等[19]發現芝麻素有通過調節 Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的趨勢，對重塑大鼠骨結構有一定影響，對骨質疏松有治療和預防作用。

本研究結果表明，菟絲子-枸杞子的主要有效成分可通過多個靶點、多個信號通路影響DOP的發生。其中TP53、JUN、MAPK14、ESR1、RELA等對DOP的發生發展有重要作用。這些基因可通過DNA-結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、脫氧核糖核酸結合性轉錄激活蛋白、配體激活的轉錄因子活性等影響DOP的發生，即主要影響細胞因子及細胞因子受體、轉錄因子等從分子水平上干預骨質疏松[20]。

KEGG富集分析顯示血脂和動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路注釋基因數相對較多，近年來，脂質與骨代謝之間的關系日益成為人們關注的焦點，越來越多的證據表明，動脈粥樣硬化（AS）和骨質疏松（OP）經常同時存在。基于實驗室和臨床的試驗表明，脂肪細胞的增加伴隨著骨密度（BMD）和骨量的減少，用于治療高脂血癥的降脂藥物他汀類也對DOP的治療有益處[21]。因此，有證據表明脂類代謝與骨代謝相關，兩者相互調節。一項橫斷面研究研究發現，骨質疏松和動脈粥樣硬化是共病的，同時發現了一個脂質組模塊及其特定的分子脂質，它與骨質疏松和動脈粥樣硬化亞臨床期的替代標記物顯著相關。所發現的脂類代謝的改變可能有助于共病條件，并為其雙基礎預防方法帶來新的可能性[22]。Suzuki等[23]研究發現體內高水平AGE使骨蛋白及骨細胞分化受到影響，導致骨形成減少，骨膠原連接障礙，骨的質量降低，脆性增加，引發骨質疏松。Zhang等[24]研究發現，在AGEs作用下，骨細胞樣MLO-Y4細胞中FOXO1基因、促凋亡基因（P53等）及下游靶基因Bax 表達增加，caspase-3活化增強，誘發骨細胞凋亡，致使骨代謝失衡。持續性高血糖狀態可導致晚期糖基化終產物（AGEs）的積累和激活晚期糖基化終產物（RAGE）信號受體，AGE-RAGE信號激活可誘導骨髓間充質干細胞（BMSC）功能障礙，使骨髓間充質干細胞成骨分化減少、炎癥增強、活性氧產生和BMSC凋亡[25]。因此菟絲子-枸杞子可通過抑制AGE-RAGE信號，減弱高糖介導的骨髓間充質干細胞功能障礙，可能是糖尿病性骨質疏松癥的潛在治療方法。AGEs可通過調節AGEs受體（RAGE）促進破骨細胞骨吸收，抑制成骨細胞骨形成。此外，AGEs破壞骨質量并通過改變骨材料成分增加骨折風險[26]。研究表明測量血清中sRAGE的水平可能在骨質疏松進展的監測中具有潛在的診斷作用，特別是在從預防和篩查階段到骨質減少水平到骨質疏松的骨折風險評估中[27]。

綜上所述，本研究從網絡藥理學角度對菟絲子-枸杞子治療DOP的潛在活性成分、關鍵基因和關鍵通路、機制進行了闡述，并通過細胞分子實驗證實了該藥對治療 OP 的協同增效作用。 結果提示該藥對在DOP的治療中可能涉及不同靶點和通路延緩DOP的進 展，體現了中醫藥治療多靶點、多途徑的治療特點。