基于信號通路探討中醫藥治療失眠的研究進展*

吳成挺，張青萍，吳鵬，周嬌嬌，李果，陳鑫源

1 廣西中醫藥大學 廣西南寧 530000

2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 廣西南寧 530000

失眠是一個公共衛生問題，最初被認為是一種癥狀，現在被定義為一種疾病[1]。其特征是難以入睡或維持睡眠，并伴有清醒時易怒或疲勞等癥狀，且影響到白天的正常活動。研究表明[2]，大約33%～50%的成年人會出現失眠癥狀。目前失眠的有效治療包括藥物、行為和認知等。簡單的行為干預在初級保健機構中是可行的，但缺乏對這些技術的培訓而限制了它們的使用。在藥物干預中，苯二氮卓受體激動劑藥物使用最多，其次為褪黑素受體激動劑和具有催眠效果的抗抑郁藥物、非典型抗精神病藥物等，但這些藥物均應限制在最低必要劑量和最短必要持續時間[3]。對于現代藥物長期的治療下，患者往往會產生不良反應及藥物的耐藥性，且部分藥物停藥后可能發生撤藥癥狀。然我國傳統醫學對于失眠治療有其獨特的優勢，因此本文基于信號通路探討中醫藥治療失眠，為中醫藥治療失眠提供更多理論依據。失眠屬中醫學“不寐”“目不瞑” “不得眠”等范疇，其基本病機為陽盛陰衰，陰陽失交，《黃帝內經》中提到“陰平陽秘，精神乃治”，因此失眠的治療主要以調和陰陽的平衡為主。

近年來，隨著細胞信號通路的興起，對與中醫藥調控細胞信號通路治療失眠的作用機制尚缺乏最新的綜述文章。本文重點對這些方面所涉及到的細胞信號通路予以綜述，整理中醫藥治療失眠的關鍵信號通路如，JAK - STAT、cAMP、TLR/NF-κB等，為進一步闡明中醫藥防治失眠提供理論依據。

JAK/STAT通路

Janus激酶（JAK）/信號換能器和轉錄激活劑（STATs）是一組與許多細胞因子發揮和整合其功能的信號轉導通路，可將細胞外細胞因子信號轉導到細胞核中轉錄變化，其作用與機體免疫反應關系密切[4-5]。在JAK/STAT信號通路中主要由三個部分組成：①接收信號的酪氨酸激酶相關受體；②傳遞信號的酪氨酸激酶JAK；③產生效應的轉錄因子STAT，其中JAK家族有 4 個成員：JAK1、JAK2、JAK3 和 TYK2。STAT家族有7個成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6[6]。該通路發揮作用的機制過程如下：（1）配體和受體之間的連接誘導 JAK 的轉磷酸化；（2）活化的 JAK 導致結合受體的酪氨酸磷酸化，形成 STAT 的對接位點；（3）在這個對接位點，JAK 磷酸化 STAT，然后 STAT 與受體解離并通過 SH2結構域-磷酸酪氨酸相互作用形成同二聚體或異二聚體；（4）這些二聚體易位至靶基因啟動子，調節靶基因的轉錄[7-8]。而轉錄因子STAT 通常可通過以下幾種機制調節轉錄：①STAT 與其 DNA 靶位點結合以驅動轉錄激活；②STAT蛋白可能與非STAT轉錄因子形成轉錄復合物，觸發STAT介導的轉錄；③ STAT 與非 STAT DNA 結合元件結合，促進 STAT 依賴性轉錄；④STAT 和非 STAT 轉錄因子可以通過與獨立的 DNA結合位點簇結合來協同激活轉錄[6]。有臨床研究發現，睡眠不足可導致單核細胞數量增加、炎癥因子系統性調節、免疫功能障礙加重[7，9-11]。睡眠不足還可以激活自發性先天免疫和STAT家族蛋白[12]。據報道，JAK/STAT3 信號通路可在睡眠剝奪患者中被激活，并且可以在微環境中通過細胞因子在小膠質細胞中進行調節，由此可見JAK/STAT3通路直接參與調節神經膠質細胞和神經元細胞的活性[13-17]。

Li L[18]等人發現，溫膽湯中主要活性成分柚皮苷（NAR）可通過抑制JAK/STAT3通路活性，抑制小膠質細胞BV-2細胞的增殖、遷移和炎癥，并增強其吞噬功能，來發揮保護BV-2細胞的作用。對于睡眠不足后免疫功能的紊亂具有一定的治療作用。章程鵬[19]等人發現睡眠剝奪會激活JAK2/STAT3信號通路，并且發現該通路的負性調節細胞因子SOCS3在睡眠剝奪下出現了顯著下降，而運用了人參-石菖蒲藥液干預后SOCS3出現了上升，并且抑制了JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，一定程度上阻斷了JAK2/STAT3信號通路的激活。說明人參-石菖蒲藥對可能是通過SOCS-3為靶點來調控JAK/STAT信號通路，起到抑制炎性反應，保護神經細胞達到促進睡眠和改善記憶的作用。

cAMP通路

環磷酸腺苷（cAMP）是胞內的第二信使，由腺甘酸環化酶 （AC）分解ATP產生，通過磷酸二酯酶（PDE）降解，其作用可以直接調節細胞的各種生物學過程或行為，包括細胞代謝、離子通道激活、基因表達、細胞生長、分化和凋亡等[20]，在信號傳導中，其上游信號傳導分子主要包括G蛋白、G蛋白偶聯受體和 AC，而cAMP主要負責傳遞 G 蛋白偶聯受體信號，其下游直接調控的靶蛋白可分為4類，目前的研究主要集中在cAMP 依賴性蛋白激酶A（PKA）和cAMP活化的交換蛋白（Epca）信號傳導，在中樞神經系統中，cAMP 能夠通過PKA-cAMP反應元件結合蛋白（CREB）和 Epac等信號通路，參與睡眠、晝夜節律調控和學習記憶等多種功能[21-24]。

1 cAMP/PKA

cAMP 依賴性蛋白激酶 PKA 是絲氨酸-蘇氨酸蛋白 AGC 激酶家族的一個特征明確的胞質全酶，并且是 cAMP信號傳導的效應激酶，在許多細胞過程中起關鍵作用，參與控制多種細胞過程，包括代謝、細胞生長、基因表達和細胞凋亡[25]。有研究表明cAMP/PKA通路不僅參與突觸可塑性和記憶存儲，而且還參與調節清醒和快速眼動 （REM） 睡眠[26]。例如，大鼠在清醒時皮質、海馬、下丘腦和腦橋中的cAMP水平相對較高，但在非快速眼動 （NREM） 睡眠和 REM 睡眠中水平較低[27]。此外，增加cAMP活性的治療可促進覺醒。相反，cAMP 活性降低已被證明會增加果蠅的休息時間[28-29]。

王慧[30]等人實驗發現氯苯丙氨酸（PCPA）模型失眠大鼠腦內5-HT合成障礙，會導致大腦皮質中cAMP和PKAmRNA的表達變化，應用酸棗仁湯后可對上述變化產生明顯的干預作用。李璟怡[31]等人運用慢性夾尾刺激和PCPA腹腔注射復合因子制造肝郁失眠模型大鼠發現，造模后模型組大鼠海馬的cAMP及PKA基因及蛋白表達均明顯降低，而運用了松郁安神方后可提高大鼠海馬的cAMP及PKA基因及蛋白的表達，發揮促睡眠作用。同時有實驗證明 PKA的靶標CREB的突變也可增加小鼠的睡眠時間[32]。CREB是一種活性依賴性轉錄因子，對突觸可塑性和記憶存儲很重要。有證據表明CREB也可能在哺乳動物的睡眠/覺醒調節中發揮作用。皮質中的磷酸化CREB水平在清醒時高于睡眠時，并且在一段時間的睡眠剝奪后升高[33-34]，這表明CREB對于維持清醒很重要。游秋云[35]等人采用改良多平臺水環境法建立自然老年24月齡Wistar大鼠快速動眼期（REM）睡眠剝奪模型，發現該模型組大鼠大腦PVN部位cAMP和p-CREB水平均明顯降低，PDE活性明顯增高，而運用酸棗仁湯后的大鼠下丘腦室旁核（PVN）部位cAMP和p-CREB水平均明顯提高，PDE活性明顯降低，提示酸棗仁湯能降低PDE的活性，激活cAMPPKA-CREB信號通路，增加cAMP和p-CREB在大腦下丘腦部位的表達，發揮安神健腦的作用。

2 cAMP/Epac

Epac是另一個重要的cAMP下游信號分子[36]。Epac有兩種同工型，Epac1和Epac2，它們充當小GTP 酶效應蛋白Rap1和Rap2的鳥嘌呤交換因子（GEF）[37-38]。Epac1 在全身表達，而 Epac2 主要在大腦、垂體、腎上腺和胰腺中表達[39-40]。有研究表明Epac 參與多種神經元功能，包括神經遞質釋放[41]、神經突生長和神經元/膠質細胞分化[42-43]，以及更高的認知功能，例如記憶、學習和社交互動[44]。

SLB[45]等人采用改良多平臺水環境法建3個月大的雄性 Wistar大鼠睡眠剝奪模型，實驗結果發現睡眠剝奪后對海馬或紋狀體的EPAC激活沒有影響。而酸棗仁湯治療失眠癥的療效確切，楊婷婷[21]等人為探討酸棗仁湯治療失眠的機制，灌服SPF級雄性成年大鼠不同濃度酸棗仁湯3天后進行采血并離心制備其血清，研究其血清對NG2神經膠質細胞分泌白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、腦源性神經營養因子（BDNF）及cAMP/Epac信號通路的影響，發現30%酸棗仁湯含藥血清組IL-1β，TNF-α，BDNF，cAMP和Epac mRNA的表達均顯著增加。表明酸棗仁湯可影響NG2細胞分泌IL-1β，TNF-α和BDNF睡眠相關的物質及cAMP/Epac信號通路參與睡眠調節。

從上述兩個實驗可推測，雖然對于睡眠剝奪后的大鼠未發現對海馬體或紋狀體的EPAC激活的影響，但激活其cAMP/Epac通路而影響其睡眠可能成為治療失眠的機制之一。

TLR/NF-κB通路

Toll樣受體（TLR）是一類跨膜識別受體，在啟動先天性炎癥反應和促進適應性免疫反應方面發揮著關鍵作用[46]。大多數 TLR 通過稱為髓樣分化因子88（MyD88）的銜接蛋白發出信號，但TLR3和TLR4除外，TLR3通過含有TIR結構域的銜接子誘導干擾素-β（TRIF）發出信號，TLR4通過兩者發出信號[47]。MyD88和TRIF途徑都通過激活核因子-κB（NF-κB）和其他轉錄因子引發轉錄改變[48]。NF-κB是產生I型干擾素和促炎細胞因子的主要驅動因素[49]，因此，TLR信號的啟動會觸發炎癥并激活先天性和適應性免疫反應[50-52]。但是并非所有的TLR都在細胞表面表達。其中識別細菌和病毒核酸的TLR3、7和9定位于細胞內膜，并在吞噬溶酶體或內體中被激活[53]。有研究顯示[54]，成年健康男性25h的睡眠剝奪足以誘導促炎細胞因子 TNF-α及其R1受體及其介質TLR-4的瞬時和可逆基因組表達。而且免疫反應的激活會使免疫物質通過復雜的分子網絡發揮睡眠調節作用[55]。由此可看出，睡眠剝奪后會引起炎癥反應，而炎性物質又會影響睡眠，可見免疫反應與睡眠是相互影響的。

劉珊等[56]運用PCPA腹腔注射制造睡眠剝奪大鼠模型檢測發現，睡眠剝奪后的大鼠其外周血NF-κB、TRIF、TNF-α、IL-1水平以及中縫背核TLR4、MyD88的表達明顯升高，而運用了天王補心丹懸濁液后上述指標均明顯下降，并且經過天王補心丹干預后大鼠睡眠潛伏期縮短，睡眠時間延長，由此可推測天王補心丹改善失眠的作用機制可能是通過抑制TLR4通路，減輕機體的炎癥反應而實現的。

同時除了中藥方面影響TLR/NF-κB通路，中醫外治方面也同樣影響該通路，起到治療失眠的作用。郭尚函[57]等人實驗證實腹腔注射PCPA的失眠大鼠脾組織中TLR4信號通路被激活，其關鍵基因TLR4、NF-κB的mRNA表達水平升高1倍，經耳穴貼壓治療后大鼠睡眠得到恢復，TLR4信號通路的關鍵基因表達水平均有不同程度的下降，提示睡眠剝奪會引起大鼠機體免疫反應，耳穴貼壓可能是通過下調TLR4信號通路關鍵基因mRNA表達水平，抑制炎癥反應并間接改善機體睡眠的作用。何華香[58]、陳桂容[59]、張金媛[60]等人運用PCPA造模失眠大鼠，發現失眠會激活大鼠TLR/NF-κB信號傳導通路，引起炎癥反應以及機體的免疫能力下降，經電針干預后，大鼠失眠癥狀緩解，TLR/NF-κB通路相關基因表達受到了抑制，降低了炎癥反應，其機體的免疫功能也可恢復至正常。

總結與展望

目前與失眠相關的信號通路研究較少，主要涉及的通路為p38 有絲分裂原活化蛋白激（p38MAPK）[61]、TLR/NF-κB、JAK/STAT、cAMP等。從上述文章中可以看出，失眠與機體免疫反應關系較為密切，兩者可相互影響，其中JAK/STAT和TLR/NF-κB通路在機體的免疫反應中占據著主導地位，而中藥及其中醫外治均可影響以上兩個通路起到調節免疫反應和治療失眠的作用，但目前關于JAK/STAT和TLR/NF-κB通路的藥物研究甚少，大多數研究集中于中醫外治調控TLR通路，降低炎癥反應，從而治療失眠，望后續的研究可多集中于藥物，為擴大我國傳統中藥治療失眠提供更多的理論依據。對于cAMP通路研究較多的下游通路在于cAMP-PKA-CREB，目前已有較多的研究證實了該通路可影響其睡眠，但目前關于中醫藥調節該通路治療失眠較多停留于cAMP-PKA通路，少數涉及至CREB轉錄因子，而CREB已被證實與睡眠具有一定的相關性，在后續的研究中可增多CREB轉錄因子相應的研究。對于cAMP/Epac通路，雖然對于睡眠剝奪后的大鼠未發現對海馬體或紋狀體的EPAC激活的影響，但有研究證實含有酸棗仁湯的血清可影響NG2神經膠質細胞分泌IL-1β，TNF-α和BDNF睡眠相關的物質及cAMP/Epac信號通路參與睡眠調節，因此可推測激活其cAMP/Epac通路而影響其睡眠可能成為治療失眠的機制之一，目前對于調節該通路治療失眠只是個假設，希望今后有學者可證實這一假設是否成立。在上述的文章中我們可以看出酸棗仁湯可影響多個通路中基因的表達，也可證明中醫藥可調控多個信號通路治療失眠，但與睡眠相關的信號通路較為復雜又相互交錯，目前的研究均只是在初步階段，后續的研究中可先從單一的通路著手，深入研究，以明確各個通路在睡眠的關鍵作用，最后再將各個相關通路交錯整合在一起，形成完整的睡眠信號通路網絡，以便于后期藥物實驗的發展。