離子通道蛋白Piezo1在人源非小細胞肺癌中的功能研究

趙敏萱,夏凡晨,劉 晨,張文悅,石金磊,康宇佳

(上海科技大學 生命科學與技術學院,上海 201210)

0 引言

肺癌是全球發病率最高的癌癥之一,2021年,世界衛生組織國際癌癥研究機構發表的2020年全球癌癥報告顯示,肺癌患者新增220萬例,僅次于乳腺癌,死亡病例數占據首位,遠超其他癌癥類型[1]。肺癌通常分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC),其中非小細胞肺癌可細分為肺腺癌、鱗狀上皮細胞癌及大細胞癌。作為長期受到氣壓、氣流及血流應力牽拉刺激的器官,肺組織的細胞中具有壓力感受器,在細胞生理功能中起重要作用[2],這些感受機械力的結構可能與肺癌發病機制相關,并有機會成為肺癌精準治療的突破口。

近年來,Piezo家族基因及其編碼的機械力敏感型離子通道蛋白受到了廣泛關注,Piezo家族蛋白能感受機械力,使陽離子通過,調節細胞的生理功能。Ca2+是細胞內重要的第二信使,影響多個信號通路,在細胞增殖、炎癥因子分泌等多種生理過程中發揮了重要作用[3]。正常細胞通過調節離子泵與離子通道的開啟及閉合,對胞內Ca2+濃度進行精確調控。Piezo1是一種Ca2+通道蛋白,在組織及器官中表達更為廣泛[4],參與多種生理功能(如脈管及血液系統的發育調節、消化與泌尿系統的功能行使與調控、運動系統發育等),并作為關鍵分子調控腫瘤的生長、增殖、分化及遷移過程[5-9]。

對肺癌的研究表明,Piezo1表達量在小細胞肺癌與非小細胞肺癌中均下調,但對于A549細胞系中Piezo1病理機制的研究尚不明確。本研究以非小細胞肺癌A549細胞為研究對象,探究Piezo1蛋白表達變化對A549細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響,并研究其對細胞內Ca2+相關通路的作用,為Piezo1蛋白在非小細胞肺癌中的進一步研究提供理論基礎,為肺癌治療提供新的分子靶標。

1 實驗方法

1.1 Piezo1敲減細胞系構建

所用細胞系為A549人源非小細胞肺癌細胞,用DMEM培養基培養,環境為37 ℃培養箱(5% CO2),siRNA采購自cohesion bioscience公司(貨號:CRH6542)提供的4管siRNA,分別是實施高效敲減的si-A、si-B、si-C及si-scrambled(簡記為si-NC),其與有效的siRNA有相同的序列組成,但是與mRNA沒有明顯的同源性,用于做轉染的陰性對照。轉染方式為脂質體轉染法,所用試劑盒名稱為Invitrogen?Lipofectamine 3000,操作步驟嚴格按照說明書進行,在96孔板中細胞匯合度達到70%～80%時實施轉染,轉染12 h后吸棄轉染液并加入正常培養體系,在轉染48 h后進行進一步實驗。

1.2 qPCR

實驗過程中用到兩次qPCR驗證基因轉錄水平,第一次用于驗證siRNA敲減后Piezo1表達在轉錄水平的變化。從各組細胞中提取mRNA,再進行mRNA的逆轉錄[所用試劑盒為Takara公司的PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time),貨號:RR036A],取用500 ng mRNA逆轉錄產物的1/25進行qPCR試劑配置。實驗結果均用QuantStudioTM進行分析。

兩次用到的qPCR引物見表1。

表1 兩次用到的qPCR引物

1.3 Western Blot

4 ℃預冷的PBS洗細胞,吸干后每個六孔板加入2.5 μL含PMSF的裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃ 14 000 rpm離心10 min,取上清以BCA法進行蛋白定量,使樣品濃度為1.5 μg/uL,95 ℃金屬浴使蛋白變性。取40 μL蛋白溶液為上樣量,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(140 V)1 h,在250 mA電流下轉膜2 h至聚偏二氯乙烯膜上,用5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1 h,向各組中分別為加入一抗,除兔抗人Piezo1外均用Western一抗稀釋液(公司:Beyotime,貨號:P0023A)稀釋,一抗分別為兔抗人Piezo1(1∶2000,5%脫脂奶粉/TBST稀釋,公司:Beyotime,貨號:AF7743)、兔抗人pAkt(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號:4060)、兔抗人Akt(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號:4691 )、兔抗人p4EBP1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號:2855)、兔抗人4EBP1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號:9644)、兔抗人pS6K1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號:9234)、兔抗人S6K1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,貨號:2708)及兔抗人GAPDH(1∶2000,公司:BBI,貨號:D110016-0025)單克隆抗體,4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,每次5 min。加入二抗山羊抗兔 I gG抗體(目的蛋白1∶6000,內參蛋白1∶10 000,公司:BBI,貨號:D110058-0025),室溫孵育1 h。ECL顯影液[Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS Stable Peroxide Solution(TH271011)和Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS Luminol/Enhancer Solution(TH270329)按體積比1∶1配置]顯色3 min后顯影。

1.4 細胞增殖水平驗證

CCK8法用于驗證細胞增殖水平,所用試劑為MedChemExpress公司購買的(貨號:HY-K0301)。實驗在96孔板中進行,具體操作方法參照說明書進行。

1.5 對于Piezo1蛋白通道的激活抑制驗證

所用到的Yoda1試劑儲存在-80 ℃中,在實驗當天從冰凍狀態取出,按照濃度梯度在室溫中稀釋,由于DMSO有細胞毒性,需要用DMSO調整,使最終梯度試劑中的DMSO含量為0.5%,令實驗條件一致。GsMTx4溶解于PBS后于-20 ℃儲存,使用當天從冰箱取出,配置濃度梯度。細胞預先鋪在96孔板中,在各孔中加入400 μL藥液及600 μL培養基后,在原細胞培養條件下繼續培養24 h。隨后吸棄原培養基,用排槍加入CCK-8試劑用于細胞增殖情況檢測,在敲減回補實驗中進行細胞轉染,轉染12 h后吸棄轉染體系,恢復到正常細胞培養體系,轉染48 h后加入藥液培養體系,放入細胞培養箱孵育24 h后吸棄藥液并進行下一步實驗處理。

1.6 劃痕實驗

取用一個新的6孔板,孔背面在水平方向上用粗頭馬克筆均勻畫三條橫線作為基準線,約每隔0.5～1 cm橫穿過孔。在6孔板中轉染細胞,轉染48 h后,待細胞匯合度達到95%以上,用移液槍取用200 μL槍頭(Parafilm包裹固定),槍頭豎直。稍用力抵靠孔底部,在中央基準線的1/3、2/3寬度處垂直于基準線慢慢在細胞層上劃兩條痕跡,過程中盡量保證力度一致。所有劃痕操作使用同一只槍頭完成,沿孔壁輕輕加入1 mL無菌dPBS洗滌2～3次,盡可能洗凈懸浮細胞及細胞碎片,避免沖散劃痕周圍細胞。更換2 mL無血清或低血清培養基,將培養皿放回37 ℃、5% CO2培養箱中培養,每隔2 h取出培養皿進行拍照。拍照時曝光時間需要保持一致,用ImageJ軟件處理圖像。

1.7 Transwell小室侵襲實驗

用不含血清的培養液稀釋Matrigel基質膠,按照每孔40 μL量將細胞接種于24孔板對應的小室上室,37 ℃孵育3 h后在超凈臺中干燥12 h。將轉染48 h的細胞用PBS清洗兩遍后消化、收集,用含10% FBS的培養基洗細胞、離心、棄上清液、收集細胞,再用含10% FBS的培養基調整細胞密度至5×105個/ mL。取150 μL細胞置于小室上室,在小室下室加入800 μL含10% FBS的培養基,緩慢將上室浸入下室,避免產生氣泡。培養48 h后,PBS清洗小室上表面,用PBS潤濕的棉簽小心擦去小室微孔膜上層的細胞,在干凈的24板小孔中加入600 μL 4% 多聚甲醛固定液(PFA),浸沒小室上下表面,固定45 min,0.1%結晶紫染20 min,置于顯微鏡下觀察、拍照,用ImageJ軟件處理圖像。

1.8 Ca2+成像

所用試劑為Fluo-4 AM熒光探針(購買自Beyotime公司,產品編號S1060),進入細胞膜后,Fluo-4AM被細胞內酯酶切割成Fluo-4游離體,游離體與Ca2+結合之后能夠發出較強熒光,用于細胞內Ca2+濃度的定量分析檢測。實驗使用6孔板,將培養狀態良好的A549細胞轉移到每孔含有3個平行細胞爬片的6孔板中,使用含有10%FBS與1%雙抗的DMEM培養基,培養至細胞匯合度為70%～90%,隨后進行正常轉染操作。轉染48 h之后,吸棄正常培養基,用PBS洗滌兩次后暫時用PBS保護細胞不處于干燥狀態,在暗處用2 mM濃度的Fluo-4AM母液配置含有2.5 μM探針的工作液共3 mL,吸棄用于清洗的PBS后,每孔加入500 μL工作液,以沒過細胞爬片。隨后用鋁箔包裹6孔板,使其處于避光條件下,在37 ℃培養箱中孵育45 min。孵育結束后,吸棄工作用1 mL含1%FBS的PBS沒過細胞表面,置于37 ℃培養箱中再次避光孵育30 min。隨后吸棄孔內液體,將每孔爬片再次用1 mL PBS清洗一遍,在載玻片上滴加抗淬滅水性封片劑7 μL,將爬片細胞面扣在封片劑內制片,吸去多余封片劑及液體之后置于熒光顯微鏡下觀察。圖像在ImageJ軟件中分析處理。

2 實驗結果

2.1 Piezo1敲減細胞系中Piezo1表達下調

RT-PCR檢測Piezo1敲減細胞系中Piezo1的mRNA表達水平,結果顯示,si-Piezo1導致mRNA的表達量明顯下調(圖1a),差異有統計學意義(P<0.0001)。WB鑒定Piezo1敲減細胞系中Piezo1蛋白表達量,結果顯示,在3個敲減細胞系中,Piezo1蛋白表達量均顯著下調,其中si-B組Piezo1蛋白表達水平下調最為明顯(圖1 b、圖1 c),表明siRNA沉默Piezo1基因表達的方法能在轉錄與翻譯水平上同時抑制Piezo1的蛋白表達。

(a)RT-PCR檢測對照組Piezo1基因轉錄水平 (b)WB檢測對照組和敲減組中Piezo1蛋白的表達情況 (c)對照組和敲減組細胞中Piezo1蛋白相對表達量

2.2 Piezo1敲減造成非小細胞肺癌A549細胞增殖能力下調

2.2.1Piezo1表達水平下降造成細胞增殖能力減弱

CCK8法檢測野生型A549細胞系與敲減細胞系細胞增殖能力,結果顯示,與對照組相比,敲減組細胞增殖能力出現顯著下調(圖2a),差異有統計學意義(P<0.01)。Piezo1通道蛋白抑制劑GsMTx4[14]處理A549細胞,結果顯示,細胞增殖能力與抑制劑濃度負相關,4 μM濃度處理的A549細胞增殖率降低程度最大,對Piezo1離子通道的抑制效果最強(圖2b)。

(a)CCK8表征siRNA敲減前后細胞增殖情況,利用單因素方差分析,顯著度分別為:si-A:P<0.0001,si-B:P<0.0001,si-C: P<0.01 (b)不同濃度抑制劑GsMTx4處理細胞后的增殖能力變化情況 (c～f)激活劑和抑制劑處理Piezo1敲減A549細胞后克隆形成情況變化,c,e為分別用不同濃度抑制劑GsMTx4和激活劑Yoda1處理后細胞克隆形成情況變化,d、f為對應數據統計結果。

2.2.2Piezo1蛋白活性降低抑制A549細胞的克隆形成

利用克隆形成模擬A549細胞在體內的增殖生長環境實驗,結果顯示,GsMTx4抑制組出現明顯差異,克隆形成率與抑制劑濃度成負相關(圖2c、圖2d),表明Piezo1通道活性下降對克隆形成起抑制作用。Yoda1激活組中各濃度未出現明顯的克隆形成率差異(圖2e、圖2f),暗示了在A549細胞系中,Piezo1的本底表達可能處于高水平。

2.3 Piezo1敲減造成非小細胞肺癌A549細胞遷移能力下調

細胞劃痕愈合實驗48 h結果顯示,與對照組Si-NC及WT相比,Piezo1基因敲減組Si-A與Si-C的遷移細胞數明顯減少,遷移率明顯降低(圖3a、圖3b),差異具有統計學意義(P<0.01)。結果表明,Piezo1敲減對非小細胞肺癌A549細胞遷移能力具有明顯的抑制作用。

(a)劃痕實驗48 h前后對比圖像 (b)各組劃痕修復的區域面積統計 (c)Transwell檢測A549細胞侵襲 (d)利用孔內平均熒光強度計算得Fluo-4AM處理后A549細胞總體熒光強度 (e)Fluo-4AM處理后的A549細胞熒光圖像 (f)利用單細胞熒光強度計算得Fluo-4AM處理后A549細胞總體熒光強度

2.4 Piezo1敲減造成非小細胞肺癌A549細胞侵襲能力下調

Transwell小室侵襲實驗12 h結果顯示,與對照組相比,Piezo1敲減組的侵襲細胞數明顯減少(圖3c),差異有統計學意義(P<0.0001)。結果表明,Piezo1敲減對非小細胞肺癌A549細胞侵襲能力有明顯的抑制作用。

2.5 Piezo1敲減造成非小細胞肺癌A549細胞胞內Ca2+濃度下降

Fluo-4 AM Ca2+探針對Ca2+成像(圖3e),結果顯示,敲減組單細胞內部及細胞系總體的胞內Ca2+含量均減少(圖3d、圖3f)。

2.6 非小細胞肺癌A549細胞Piezo1敲減影響下游信號

2.6.1 非小細胞肺癌A549細胞Piezo1敲減后影響Ca2+通道下游磷酸化水平

Piezo1本身作為壓力敏感型Ca2+通道,可能通過將機械應力信號轉化為胞內Ca2+濃度信號,觸發下游相關的信號通路,調控細胞的增殖及遷移表型。研究認為,Ca2+水平上升可能調控Akt磷酸化并啟動下游通路[15],在經典通路中,Akt磷酸化抑制tuberin,解除TCS2對Rheb的抑制調控[16-17],使mTOR通路被激活并進一步磷酸化下游的4EBP1和S6K1[18],其磷酸化同步表征mTORC1的磷酸化水平。4EBP1磷酸化導致elF4E轉錄因子活化,從而激活基因轉錄及細胞增殖與遷移。WB結果顯示,在Piezo1敲減細胞系中,pAkt的磷酸化水平被下調(圖4a),4EBP1蛋白的磷酸化水平顯著提高(圖4b),而S6K1蛋白的磷酸化水平則沒有發生顯著的改變(圖4c)。

2.6.2 非小細胞肺癌A549細胞Piezo1敲減后影響增殖、遷移及侵襲下游信號

由于轉錄因子的活化,選擇下游部分基因,通過RT-PCR鑒定mRNA表達量,結果顯示,敲減細胞系中,與增殖相關的Myc[19-20]、Cyclin-D1[21]、Cyclin-E[22]、CDK2轉錄水平均有明顯下調(圖4d),與遷移、侵襲表型相關的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin[23]等基因轉錄水平出現明顯上調(圖4e),其中si-B的效果較明顯,表明Piezo1蛋白通過影響與增殖及遷移相關基因的表達,最終影響肺癌細胞的發生發展。

3 討論

Piezo1是由一個長達2547個氨基酸構成的三聚體,呈螺旋槳式結構,各亞基通過36個跨膜域及2個跨膜域組成的離子通道錨定在細胞膜上[24]。研究認為,Piezo1蛋白結構構象契合杠桿作用原理,可能通過體外周跨膜螺旋單位(THU)作為機械力感受器,通過杠桿完成力的傳遞。研究發現,Piezo1不僅可以感受外界機械應力,還可以感知內源機械應力[25],從而認為Piezo1不只在膜上作為壓感型離子通道,也在胞內通過細胞內蛋白復合體響應蛋白內應力并參與細胞內功能行使,這意味著Piezo1在細胞內信號通路中仍有尚未解析的功能。

本實驗探究了Piezo1蛋白表達量與細胞增殖、遷移及侵襲能力之間的關系。實驗結果表明,通過siRNA敲減Piezo1降低Piezo1蛋白的表達,可以顯著降低A549細胞系的增殖、遷移及侵襲能力。在使用Piezo1蛋白抑制劑GsMTx4處理A549細胞系后得到了與siRNA敲減相似的實驗結果。需要指出的是,GsMTx4是一種廣譜性用于抑制壓力敏感型離子通道的抑制劑[26],并不是Piezo1的特異型抑制劑,因此不能直接說明細胞的功能缺失完全是由Piezo1受到抑制而導致的。

在敲減細胞系中加入Piezo1蛋白的特異型激活劑Yoda1發現,該激活劑可以部分恢復癌細胞的增殖能力,這從另一個角度證實了A549細胞系增殖能力的下降確實是由于Piezo1蛋白表達量降低所引起的。然而,用Yoda1處理野生型A549細胞發現,其對細胞增殖能力的改變并不明顯,這表明在A549細胞系中Piezo1的本底表達與通道活性相對較高。劃痕實驗與Transwell小室侵襲實驗進一步證實Piezo1敲減造成A549細胞遷移及侵襲能力下降。

研究認為,作為機械力敏感的陽離子通道蛋白,Piezo1可能通過影響細胞內的Ca2+濃度調控細胞表型。胞內Ca2+探針實驗結果表明,Piezo1敲減細胞Ca2+濃度下降明顯。有文獻指出,Piezo1敲減的人源骨髓巨噬細胞中,PI3K/Akt途徑受到抑制,其中Akt磷酸化水平降低而PI3K表達沒有受到影響,暗示Piezo1采用一種PI3K之外的Akt激活途徑[27],由此猜測在非小細胞肺癌中,Ca2+變化可能通過某種方式影響Akt磷酸化水平,因而嘗試驗證在A549中Piezo1與Akt激活的關系。結果表明,敲減Piezo1降低Piezo1蛋白的表達能夠導致A549細胞中Akt磷酸化水平的降低,與之前的研究結果一致。

由于Akt通路下游的mTORC1通路與細胞增殖相關,進一步驗證了Piezo1影響細胞增殖、遷移及侵襲的下游分子機制十分必要。在基因轉錄水平上探究增殖相關的Myc、Cyclin-D1、Cyclin-E、CDK2與遷移相關的E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的表達情況。RT-PCR結果表明,Myc、Cyclin-D1、Cyclin-E、CDK2轉錄水平明顯下調,與前期細胞增殖表型的下調相一致,E-cadherin、N-cadherin、Vimentin轉錄水平則明顯上調。在細胞上皮間充質轉化(EMT)過程中,遷移相關的三個靶標發揮著重要的作用。E-cadherin作為本地黏附分子在EMT過程中表達量降低,而N-cadherin與Vimentin表達量增加,增強細胞的移動能力以完成EMT過程[24]。在EMT過程中,細胞需要解除自身與周圍介質的黏附才能開啟一系列的遷移模式,因此作為EMT過程的開端,E-cadherin的表達下調非常重要。在轉錄水平上,E-cadherin的上調可能比N-cadherin及Vimentin的作用更為突出,從而導致宏觀上A549細胞的遷移能力減弱。

近年來,人們一直在研究Piezo1與疾病之間的關系。不同類型的癌癥中,Piezo1的作用不盡相同。在骨肉瘤中,Piezo1激活后促進細胞凋亡,而敲減Piezo1則會影響腫瘤形成能力并挽救細胞凋亡[28]。在肝細胞癌(HCC)中,Piezo1表達顯著上調,敲低Piezo1會導致細胞增殖、遷移、克隆形成及體內腫瘤形成等方面的顯著損傷[29]。在MCF-7乳腺癌細胞中阻斷Piezo1通道的功能會減弱細胞的遷移能力[30]。在結腸癌中Piezo1表達量的上調,過度表達Piezo1可促進結腸癌細胞的遷移及侵襲[31-32]。在胃癌細胞中敲低Piezo1可減弱細胞的遷移能力[33]。

本研究對Piezo1下游信號通路的實驗驗證了敲低Piezo1會影響Akt的磷酸化進程,并進一步影響增殖相關蛋白的轉錄活動,從而導致A549細胞增殖表型受到抑制。目前已經研究過的Piezo1相關下游通路包括激活ORAI1通路并引發淋巴管萌芽[34],在肺動脈中激活Akt與eNOS[35],在卵巢癌中激活Hippo/YAP通路[36],在HCC組織中通過招募Rab5c來激活TGF-β通路[29]，在H1-L細胞系中激活CaM/Src/Pitx2通路[37],在神經干細胞中激活BMP2/Smad通路并調控干細胞發育[38]等。Piezo1的具體下游通路仍需進一步驗證。