SLC6A1基因變異導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙的家系分析

陳麗卿, 付俊一, 蘇堂楓, 劉 艷

SLC6A1基因(MIM 137165)定位于染色體3p25.3,在人類(lèi)和其他動(dòng)物的發(fā)育期與成熟大腦中均廣泛表達(dá)。SLC6A1基因編碼γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(gamma-aminobutyric transporter 1,GAT-1),該蛋白負(fù)責(zé)突觸γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric,GABA)的再攝取和細(xì)胞外間隙清除[1,2]。當(dāng)SLC6A1基因發(fā)生致病性突變時(shí),GAT-1功能喪失,影響突觸前膜從細(xì)胞外再攝取GABA,從而誘發(fā)癲癇。目前國(guó)內(nèi)SLC6A1基因變異導(dǎo)致的癲癇報(bào)道少,主要報(bào)道的癲癇發(fā)作類(lèi)型為肌陣攣-失張力發(fā)作及失神發(fā)作,且都為散發(fā)病例[3,4],我們報(bào)道1組SLC6A1 基因雜合變異引起癲癇的家系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 先證者,女,于2歲6月齡就診于我科門(mén)診,系第1胎第1產(chǎn),足月順產(chǎn),出生無(wú)窒息史。4月齡抬頭,8月齡獨(dú)坐,1歲8月齡獨(dú)行。獨(dú)立行走后出現(xiàn)腿抖,伴有頻繁眨眼,獨(dú)站不穩(wěn)及摔跤,無(wú)腿抖時(shí)可以獨(dú)行。就診時(shí)會(huì)說(shuō)2個(gè)字。于2歲3月齡時(shí)曾行康復(fù)訓(xùn)練,仍有間斷腿抖,摔跤,不敢行走。語(yǔ)言無(wú)進(jìn)步。查體:體重12 kg,頭圍49 cm。面容無(wú)特殊,四肢肌力、肌張力正常,病理反射未引出。指鼻試驗(yàn)不配合?？煞鲂?叫名無(wú)回應(yīng)。血肝腎功能、電解質(zhì)、乳酸、丙酮酸、血氨、空腹血糖、血尿代謝篩查正常。視覺(jué)及聽(tīng)力誘發(fā)電位正常。視頻腦電圖(video electroencephalogram,VEEG):背景節(jié)律慢化(δ、θ混合慢波);睡/醒期見(jiàn)雙側(cè)前頭部、后頭部或廣泛性高波幅慢波、棘慢波或節(jié)律發(fā)放(見(jiàn)圖1)。頭部磁共振(magnetic resonance imaging,MRI):雙側(cè)額葉斑點(diǎn)狀高T2Flair信號(hào)灶,少許脫髓鞘病變可能(見(jiàn)圖2);左側(cè)顳角較右側(cè)大。Gesell嬰幼兒發(fā)育量表:一般發(fā)育水平約21個(gè)月,各項(xiàng)發(fā)育落后,發(fā)育商64。兒童孤獨(dú)癥評(píng)定量表提示無(wú)明顯孤獨(dú)癥表現(xiàn)。

圖1 VEEG:背景節(jié)律慢化(δ、θ混合慢波);睡/醒期見(jiàn)雙側(cè)前頭部、后頭部或廣泛性高波幅慢波、棘慢波或節(jié)律發(fā)放

圖2 頭部MRI:雙側(cè)額葉斑點(diǎn)狀高T2 Flair信號(hào)灶,少許脫髓鞘病變可能

家族史:基因結(jié)果出來(lái)后追問(wèn)病史獲知患兒母親年幼時(shí)有癲癇發(fā)作,曾口服藥物治療1年(具體不詳)。目前無(wú)發(fā)作,但反應(yīng)稍遲鈍?；純和馄庞讜r(shí)有抽搐病史,用藥不詳,目前無(wú)發(fā)作。

1.2 方 法

1.2.1 家系全外顯子組測(cè)序 經(jīng)監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū),并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后,抽取患兒及父母,外婆外周血3 ml,提取DNA。應(yīng)用 xGen Exome Research Panel v1.0 進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲,使用illumina Hiseq X-ten 二代測(cè)序儀對(duì)富集的文庫(kù)進(jìn)行 PE150 測(cè)序,平均測(cè)序深度為 100X,95%以上的區(qū)域達(dá)到 20X 以上的覆蓋度。

1.2.2 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)檢測(cè) 使用甲基化特異性的MLPA試劑盒(荷蘭MRC-Holland公司,ME028),檢測(cè)15q11.2-q13區(qū)域印記區(qū)缺陷、甲基化及單親二倍體。

1.2.3 Sanger測(cè)序 應(yīng)用Sanger測(cè)序?qū)Y查到的變異進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)對(duì)其父母及外婆的相同基因位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 文獻(xiàn)復(fù)習(xí) 以“SLC6A1”、“癲癇”及“SLC6A1”、“epilepsy”為關(guān)鍵詞,對(duì)萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)知網(wǎng)和Pubmed建庫(kù)至2023年1月收錄的論文進(jìn)行檢索,并總結(jié)攜帶SLC6A1基因突變的國(guó)內(nèi)患兒的臨床表型和基因突變特點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 治療及隨訪(fǎng) 患兒于2歲6月齡加用丙戊酸治療(11 mg/kg·次,bid),隨訪(fǎng)至2022年10月,有20個(gè)月無(wú)發(fā)作,可獨(dú)立行走、奔跑,語(yǔ)言障礙較前明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 全外顯子測(cè)序結(jié)果 發(fā)現(xiàn)先證者存在SLC6A1基因c. 889G>A(p. Gly297Arg)的雜合變異,屬于常染色體顯性遺傳,此變異來(lái)自母親及外婆(見(jiàn)圖3)。已有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)該變異位點(diǎn),但Carvill等[5]報(bào)道的攜帶該變異位點(diǎn)的患兒有重度智力障礙,自閉癥特征、攻擊行為、脊柱側(cè)彎、多種癲癇發(fā)作形式及對(duì)多種抗癲癇發(fā)作藥物療效差。Aguilera等[6]報(bào)道的患兒與本例相似,臨床表型相對(duì)要輕,表現(xiàn)為Angelman樣綜合征,且丙戊酸單藥控制良好。Piniella等[7]通過(guò)在過(guò)表達(dá)SLC6A1基因Gly297Arg突變體的人胚胎腎細(xì)胞293(human embryonic kidney 293,HEK293)中檢測(cè)GABA攝取活性,發(fā)現(xiàn)與野生型(Wide-type,WT)相比,其攝取活性顯著下降(低于WT的5%),證明該變異為致病性變異。

圖3 家系全外顯子組測(cè)序:先證者存在SLC6A1基因c. 889G>A(p. Gly297Arg)的雜合變異。此變異來(lái)自母親及外婆

2.3 MLPA檢測(cè) 本例患兒發(fā)作間期2次腦電圖均表現(xiàn)為背景節(jié)律慢化(δ、θ混合慢波),醒睡期均可見(jiàn)雙側(cè)前頭部、后頭部或廣泛性高波幅慢波、棘慢波,與Angelman綜合征患兒腦電圖表現(xiàn)相似,且患兒有全面性發(fā)育遲緩、言語(yǔ)障礙及刻板動(dòng)作,但患兒并無(wú)Angelman綜合征快樂(lè)面容。所以本例基因檢測(cè)方法包括MLPA檢測(cè),排除Angelman綜合征可能。結(jié)果染色體15q11-q13區(qū)域MLPA檢測(cè)顯示,在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)拷貝數(shù)和甲基化位點(diǎn)未見(jiàn)異常。

2.4 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 先證者SLC6A1基因存在c. 889G>A(p. Gly297Arg)的雜合變異。先證者母親及外婆均存在同樣的雜合變異(見(jiàn)圖3)。

2.5 文獻(xiàn)復(fù)習(xí) 以“SLC6A1”“癲癇”以及“SLC6A1”“epilepsy”為關(guān)鍵詞,對(duì)萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)知網(wǎng)、Pubmed建庫(kù)至2023年1月收錄的論文進(jìn)行檢索,共檢索到4篇[3,4,8,9]關(guān)于國(guó)內(nèi)患兒攜帶SLC6A1基因變異的報(bào)告。結(jié)合本例患兒,目前國(guó)內(nèi)共報(bào)道8例(男5例,女3例)SLC6A1突變的患兒(見(jiàn)表1)。8例患兒均有癲癇發(fā)作,起病年齡1～3歲。發(fā)作類(lèi)型包括失神發(fā)作(5例,其中1例為不典型失神),肌陣攣發(fā)作(6例),肌陣攣-失張力發(fā)作(5例),全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作(1例)。腦電圖均可見(jiàn)廣泛性棘慢波、多棘慢波發(fā)放,2例患者背景節(jié)律正常。8例患兒均存在發(fā)育遲緩,語(yǔ)言發(fā)育落后是突出特征。2例患兒報(bào)道存在自閉癥樣表現(xiàn),1例患兒報(bào)道存在刻板樣動(dòng)作,1例患兒報(bào)道存在注意缺陷多動(dòng)障礙。頭部核磁檢查無(wú)特異性異常表現(xiàn)。所有患兒均加用丙戊酸抗癲癇治療,7例患兒對(duì)抗癲癇藥反應(yīng)良好,6例隨訪(fǎng)后期無(wú)發(fā)作,1例發(fā)作次數(shù)明顯減少。1例患兒表現(xiàn)為難治性癲癇。除本例患兒SLC6A1基因存在家系遺傳,其余患兒均為新發(fā)突變。1例為剪切變異,2例為無(wú)義變異,1例為缺失變異,其余4例均為錯(cuò)義變異。1例存在SLC6A1基因缺失變異的患兒還存在NOTCH1和PRIMPOL基因變異,所以該患者還具有主動(dòng)脈瓣狹窄和高度近視的表現(xiàn)。

表1 8例SLC6A1基因變異的國(guó)內(nèi)患兒臨床特征及基因型

3 討 論

SLC6A1相關(guān)疾病在2015年被首次描述[5]。SLC6A1 基因包含16個(gè)外顯子,長(zhǎng)度約46.5 kb,其編碼的GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)體 GAT-1 主要位于 GABA 能中間神經(jīng)元的軸突和神經(jīng)終端,GAT-1可從突觸間隙重?cái)z取GABA。GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),調(diào)節(jié)抑制性突觸傳遞作用,從而防止腦內(nèi)神經(jīng)元過(guò)度興奮[10]。目前研究表明,SLC6A1基因變異,可引起多種神經(jīng)發(fā)育障礙。Goodspeed等總結(jié)了116例SLC6A1基因變異患者的臨床資料,發(fā)現(xiàn)癲癇(91.1%)、發(fā)育遲緩及認(rèn)知障礙(82.1%)、自閉癥(22.8%)是最常見(jiàn)的臨床特征[11]。

在一項(xiàng)隊(duì)列研究中,采用高通量測(cè)序(next generation sequencing,NGS)聯(lián)合拷貝數(shù)變異,對(duì)9 769例兒童癲癇患者進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)SLC6A1被列為致病變異數(shù)較多的前10～20個(gè)基因之一[12]。

Johannesen等[13]報(bào)道16例SLC6A1基因突變患者,13例為點(diǎn)突變、3例為缺失突變,臨床表現(xiàn)為癲癇2 例(發(fā)作形式包括肌陣攣發(fā)作、失神發(fā)作、非驚厥性癲癇持續(xù)狀態(tài)、失張力發(fā)作、全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作、肌陣攣失張力發(fā)作),智力障礙16例(輕度智力障礙患者 11 例、中度智力障礙患者 4 例、1 例為嚴(yán)重的智力障礙),語(yǔ)言發(fā)育遲滯2 例,孤獨(dú)癥7例,注意力不集中2例等。但國(guó)內(nèi)報(bào)道的8例患兒均有癲癇發(fā)作和發(fā)育遲緩,且語(yǔ)言發(fā)育遲滯是突出特點(diǎn)。

目前認(rèn)為SLC6A1基因突變是發(fā)育性和癲癇性腦病的原因之一。據(jù)報(bào)道[11],癲癇首次發(fā)作的平均年齡是2.5歲。最常見(jiàn)的癲癇綜合征是早發(fā)性癲癇伴肌陣攣失張力發(fā)作(20/82,24.3%),其次是遺傳性全面性癲癇(19/82,23.1%)和非獲得性局灶性癲癇(8/82,9.75%)。在56例獲得詳細(xì)癲癇發(fā)作形式的患者中,最常見(jiàn)的是不典型失神發(fā)作(71.7%)、失張力發(fā)作(44.4%)和肌陣攣發(fā)作(27.7%)。廣泛性癲癇樣放電(36/52,69.2%)是最常見(jiàn)的腦電圖異常,可伴有背景節(jié)律變慢。這些特征與國(guó)內(nèi)病例相似。但是對(duì)SLC6A1相關(guān)疾病而無(wú)癲癇發(fā)作的個(gè)體的腦電圖特征目前知之甚少。本例患兒的腦電圖特征是背景節(jié)律慢化,醒睡期可見(jiàn)雙側(cè)前頭部、后頭部或廣泛性高波幅慢波、棘慢波,與Angelman綜合征患兒腦電圖表現(xiàn)相似,雖然患兒并無(wú)Angelman綜合征的快樂(lè)面容,但考慮到患兒有全面性發(fā)育遲緩、言語(yǔ)障礙及刻板動(dòng)作,所以本例基因檢測(cè)方法包括MLPA檢測(cè),排除Angelman綜合征可能。根據(jù)Aguilera等的報(bào)道[6],通過(guò)全外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)14例Angelman樣綜合征患兒進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)了10種可引起Angelman樣綜合征的新的基因,其中之一就包括SLC6A1基因,且突變位點(diǎn)和本例患兒相同。Angelman綜合征是母源UBE3A基因功能異常導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)育遺傳性疾病。Aguilera等認(rèn)為,SLC6A1基因變異出現(xiàn)Angelman樣綜合征,可能由于SLC6A1基因受到UBE3A基因的調(diào)控。但文獻(xiàn)中更多的關(guān)注基因型與表型之間的關(guān)系,對(duì)于腦電圖特征并未進(jìn)行描述。

在一項(xiàng)較大的關(guān)于自閉癥測(cè)序的研究中(n=11 986),與23598個(gè)健康對(duì)照者相比,SLC6A1是自閉癥患者變異較豐富的前10個(gè)基因之一[14]。有學(xué)者總結(jié)了27 例SLC6A1基因變異患兒的基因型與臨床表型,18 例起病前有發(fā)育遲緩,11 例起病后出現(xiàn)發(fā)育倒退,9 例有自閉癥表現(xiàn),100%病例均遺留不同程度的智力障礙(intellectual disability,ID),語(yǔ)言障礙是最常見(jiàn)的特征[3]。本例患兒有明顯語(yǔ)言障礙,雖有一些刻板動(dòng)作,但自閉癥相關(guān)量表評(píng)估未達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)。且國(guó)內(nèi)病例僅有2例報(bào)道有自閉癥樣表現(xiàn)。

Goodspeed等[11]總結(jié)的116例SLC6A1基因變異患兒中發(fā)現(xiàn)85 種變異,變異類(lèi)型包括88個(gè)錯(cuò)義變異,15個(gè)導(dǎo)致功能完全喪失的蛋白質(zhì)截?cái)嘧儺?7個(gè)剪接位點(diǎn)的變異,3個(gè)拷貝數(shù)大的缺失變異,2個(gè)小的插入和缺失和1個(gè)同義變異,其中錯(cuò)義變異最常見(jiàn)(75.8%)。本例患兒為SLC6A1基因c.889G>A(p.Gly297Arg)變異為錯(cuò)義變異,既往已有文獻(xiàn)報(bào)道[5～7],但雖為同一位點(diǎn)突變,既往報(bào)道的患兒臨床表型嚴(yán)重程度與本例有差異,Carvill等[5]報(bào)道的患兒臨床表現(xiàn)為重度智力障礙,自閉癥特征、攻擊行為、脊柱側(cè)彎、多種癲癇發(fā)作形式及對(duì)多種抗發(fā)作藥物療效差。最近的一些研究已經(jīng)證明不同類(lèi)型的變異對(duì)GAT-1活性的影響程度不同,比如截?cái)嘧儺惪赡軐?dǎo)致單倍劑量不足從而降低GAT-1表達(dá),而一些錯(cuò)義突變可能通過(guò)顯性-陰性效應(yīng)導(dǎo)致GAT-1表達(dá)更低[15]。Piniella等[7]的研究結(jié)果顯示,本例患兒攜帶的Gly297Arg變異對(duì)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊懯歉叨扔泻Φ?且該變異的GAT-1被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,完全無(wú)活性。這些研究表明,突變的GAT-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的保留和降解會(huì)導(dǎo)致經(jīng)過(guò)正確折疊、翻譯、修飾的功能性GAT-1表達(dá)降低[16]。但這些仍不能解釋即使是同一種變異,其臨床表型也有差異,基因型和表型的相關(guān)性,還需進(jìn)一步的深入研究。

目前還沒(méi)有針對(duì)SLC6A1相關(guān)疾病的精準(zhǔn)治療藥物,大多數(shù)患者需多學(xué)科聯(lián)合治療,包括神經(jīng)病學(xué)、發(fā)育兒科、遺傳學(xué)以及言語(yǔ)和職業(yè)治療,以進(jìn)行綜合管理[17,18]。根據(jù)之前研究,丙戊酸是最有效的抗癲癇藥物,拉莫三嗪和乙琥胺也顯示效果良好[19],此外,其他調(diào)節(jié)GABA濃度的抗癲癇藥,如氨己烯酸和噻加賓也可能發(fā)揮作用[20]。本例患兒采用丙戊酸單藥治療即有效,且患兒母親及外婆僅幼時(shí)有癲癇發(fā)作,抗癲癇藥治療效果良好。但仍有許多SLC6A1基因變異患者表現(xiàn)為難治性癲癇。Mermer等[15,16,21]研究發(fā)現(xiàn),用4-苯基丁酸(phenylbutyrate,PBA)處理攜帶致病性SLC6A1變異的細(xì)胞,可增加GAT-1的活性。這可能是由于PBA作為伴侶蛋白,減少了突變的GAT-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的保留,并增加了功能性GAT-1的表達(dá)。這項(xiàng)研究可能會(huì)對(duì)藥物治療SLC6A1相關(guān)疾病做出進(jìn)一步貢獻(xiàn)。

綜上所述,本研究中SLC6A1基因變異患兒主要表現(xiàn)為幼兒期起病的肌陣攣失張力癲癇,同時(shí)伴有輕度的認(rèn)知障礙及語(yǔ)言障礙,藥物治療后無(wú)發(fā)作?；純耗赣H及外婆臨床表型較患兒輕,僅有幼時(shí)癲癇發(fā)作,而無(wú)明顯認(rèn)知障礙。通過(guò)文獻(xiàn)復(fù)習(xí),SLC6A1基因變異可導(dǎo)致多種神經(jīng)發(fā)育障礙臨床表型,可表現(xiàn)為癲癇(失神、失張力、肌陣攣及肌陣攣-失張力發(fā)作為主)、發(fā)育遲緩、認(rèn)知障礙、孤獨(dú)癥或孤獨(dú)癥樣表現(xiàn)及注意缺陷多動(dòng)障礙等。SLC6A1基因突變可以為錯(cuò)義變異、無(wú)義變異、移碼變異、剪切變異、染色體微缺失等。基因型與表型之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。化學(xué)伴侶蛋白PBA是治療SLC6A1相關(guān)疾病的潛在有效藥物。