杜仲腰痛丸對脊髓損傷后NLRP3炎癥小體表達的影響

元寶華 李興勇 方鵬飛 藺海生 劉曉婷

摘要：目的 觀察杜仲腰痛丸對大鼠脊髓損傷后NLRP3炎癥小體表達的影響，探討該藥對脊髓損傷后炎癥反應的作用和其作用原理

方法 將50只SD大鼠隨機分成5組，每組10只。分別是A組（低劑量組）、B組（中劑量組）、C組（高劑量組）、D組（模型組）、E組（假手術組）。A組、B組、C組與D組進行脊髓損傷造模，E組行椎板切除術。A組、B組、C組分別按照濃度梯度給予杜仲腰痛丸干預，D組和E組則給予同等量的生理鹽水干預，實驗的前后每組分別采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）運動能力評定量表評估大鼠后肢的聯合運動功能，實驗第7天取材檢測NLRP3蛋白的相對表達，并分析其結果。

結果 術后A組、B組、C組的BBB評分均優于D組（P<0.05），治療效果有時間依賴性；免疫組化法D組同E組相比較，D組NLRP3炎癥體表達相對比較高，差異有統計學意義（P<0.05）；A組、B組、C組與D組相比較，A組、B組、C組NLRP3表達相對減少，C組的表達相對最少，差異有統計學意義（P<0.05）。

結論 證實杜仲腰痛丸可以抑制脊髓損傷部位NLRP3的表達，減緩炎癥反應。

關鍵詞：杜仲腰痛丸；脊髓損傷；NLRP3；炎癥反應

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1007-2349（2023）07-0001-03

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱節段控制系統和自主神經系統被破壞，導致痙攣性麻痹、疼痛感覺遲鈍、交感神經遲鈍和副交感神經興奮，產生心律失常、全身性低血壓、支氣管收縮、呼吸道產生大量分泌物、腸道、膀胱和性功能障礙等癥狀，具有比較高的發病率以及致殘率［1-4］。由于血脊髓屏障的破壞，損傷部位組織缺血，循環系統內炎癥細胞趨化因子誘導損傷組織周圍發生炎癥反應，致使炎癥反應介導周圍組織壞死和凋亡。而在SCI后眾多病理反應中，炎癥反應對機體產生影響最大。杜仲腰痛丸（由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等組成）常用于治療脊柱源性疾病，研究證實杜仲腰痛丸可以抑制炎癥反應，起到緩解疼痛的作用［5-6］。但杜仲腰痛丸能否抑制SCI后NLRP3炎性小體介導的炎性反應，尚未有這方面的實驗研究。本研究將杜仲腰痛丸應用于脊髓損傷動物模型，觀察其對SCI后NLRP3炎癥體表達的影響，并探討其中機理。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠50只，6-8周齡，體重（210±9.70）g，于中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心購得，許可證號碼：SCXK（甘）2020-0002，所有大鼠按照動物實驗管理與操作實用指南進行照料和處理，每籠5只，在相同條件下飼養，適應性喂養為期1周，若此期間實驗動物沒有出現不良反應，繼而開展相關實驗。

1.1.2 實驗材料 杜仲腰痛丸，組成包括杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等十七味中藥，每瓶220丸，每粒含生藥0.18 g，由甘肅省中醫院制劑中心生產，產品批號：210653。配制成每毫升含生藥0.05 g的藥液，無菌條件下裝入試劑瓶冰箱低溫冷藏保存備用。實驗中用到的試劑：兔抗鼠NLRP3抗體（Proteintech）；免疫組化試劑盒（博士德）。

1.2 實驗方法 50只SD大鼠被隨機分成5組，每組10只。分別是A組（低劑量組）、B組（中劑量組）、C組（高劑量組）、D組（模型組）、E組（假手術組）。所有大鼠均用1％戊巴比妥鈉（60 mg/Kg）腹腔注射麻醉。8％Na2S背部脫毛，常規消毒后鋪無菌洞巾，定位棘突后以T10棘突為中心，用手術刀切開皮膚形成一道長約3cm的切口，鈍性剝離周圍軟組織后顯露T10、T9、T11的棘突，并用蚊式咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，形成大小約4×8 mm的骨窗，暴露脊髓背側硬膜，用止血鉗輕夾脊髓，出現后肢伸展和甩尾反射則標志著建模成功，形成中度及重度脊髓損傷模型。E組（假手術組）只進行椎板切除，脊髓沒有受到壓迫。局部使用適量青霉素，預防施術部位發生感染，逐層縫合關閉切口，術中所有操作必須在無菌條件下進行。為防止術后感染，給予青霉素腹腔注射3 d，4萬單位／N／只。觀察大鼠皮膚有無損傷或感染，必要時繼續注射青霉素。保持室溫20～25℃，相對濕度在50%～65%，提供（12 h光照/12 h黑暗）穩定的晝夜光照變化，保持24 h通風換氣，大鼠在整個實驗期間可自由獲取食物和水。為防止大鼠聚集舔舐背部傷口，所有大鼠均在清潔環境下單籠飼養。食物為商用大鼠顆粒飼料，飲水瓶為無毒耐高壓塑料材料制成，飲水和飲水瓶經過高溫滅菌消毒后使用，每日定時投食更換飲水，確保大鼠有充足的營養供給。每天進行兩次人工排尿，并清除大鼠尿道附近污漬并消毒，以防止尿路感染，一直持續到大鼠恢復自主排尿功能。造模成功之后，A組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為0.42 g/（kg·ｄ），每日2次；B組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為0.84 g/（kg·ｄ），每日2次；C組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為1.68 g/（kg·ｄ），每日2次；D組和E組分別給予等量的生理鹽水，每日2次。連續干預7 d。所有動物均在實驗期間存活，無不良反應，并納入數據分析。

1.3 觀察指標 每組大鼠分別在術前及術后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d用 BBB肢體運動功能評分（范圍為0～21分）；術后第7 d取材，運用免疫組化法檢測NLRP3炎癥體表達。

1.4 統計學方法 運用SPSS20.0統計軟件進行實驗數據統計分析，實驗數據收集用（x±s）表示，符合正態分布用ｔ檢驗或單因素方差分析，非正態分布資料用秩和檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

我們發現A組、B組、C組和D組的大鼠在SCI后立即失去后肢活動功能，治療結果顯示杜仲腰痛丸能促進神經元功能恢復，并且有時間依賴性。我們的BBB評分（表1）顯示，A組的功能恢復明顯高于D組，表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的運動功能恢復。我們使用免疫組化技術評估了每組NLRP3炎癥體的表達變化。

2.1 BBB評分 用BBB運動評定量表評定大鼠后肢的運動功能。于術前及術后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d，將各組大鼠置于開闊場地內自由活動，記錄員（雙人、雙盲）負責對每只大鼠的后肢運動能力評分。每只大鼠的運動評分最終結果取平均值，得出結果值并進行統計學分析（表1）。

與E組相比較，A組、B組、C組和D組的BBB肢體運動功能評分顯著下降，但是隨著治療時間的延長，A組、B組、C組和D組的BBB肢體運動功能評分逐漸升高，到手術后第3天開始，A組、B組、C組BBB肢體運動功能評分優于D組同時期的結果（P<0.01）（見圖1）。這表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的運動功能，促進神經元的恢復。

2.2 免疫組化學法檢測NLRP3炎癥體的變化 運用免疫組化學法檢測，NLRP3炎癥小體陽性表達呈深灰褐色，表達的位置主要在細胞漿之中（見圖2）。E組只能觀察到少量的NLRP3炎癥小體表達，D組中NLRP3炎癥小體在細胞漿中大量表達（見表2），A組的NLRP3炎癥體表達量明顯少于D組，差異有統計學意義（P<0.05）（見圖3）。

3 討論

本實驗研究顯示，運用免疫組化學法檢測，NLRP3炎癥小體陽性表達呈深灰褐色，表達的位置主要在細胞漿之中。E組只能觀察到少量的NLRP3炎癥小體表達，D組中NLRP3炎癥小體在細胞漿中大量表達，A組、B組、C組的NLRP3炎癥體表達量明顯少于D組，說明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，減輕脊髓損傷后繼發的炎癥反應，從而起到保護神經細胞的作用。

炎癥反應是造成脊髓繼發性損傷的主要原因，脊髓損傷后使小膠質細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及淋巴細胞被激活，這些細胞會分泌大量的炎性細胞因子和趨化因子，致使炎癥區域擴大，形成纖維蛋白凝塊和膠質瘢痕，并釋放大量抑制神經和突觸修復的細胞因子（如 IL-1、TNF-α和 IL-6），炎癥反應進一步加重，從而讓中樞神經系統的再生和修復變的更加艱難［7-9］。

NLRP3炎性小體是免疫系統實現免疫功能重要的一個組成部分，作為caspase-1的激活平臺，它可以控制細胞炎癥因子和細胞因子的處理和釋放［10-11］。NLRP3在特定的條件下被激活后，使caspase-1發生活化，活性的caspase-1則會促進IL-1β和IL-18的活化［12-13］，IL-1β和IL-18都促進活性氧（ROS）的積累，而ROS又充當損傷相關的分子模式（DAMPs），使NLRP3炎性體被激活和caspase-1發生活化，進一步產生IL-18和凋亡激活，從而引起反饋環，使炎癥反應進行性加重［10，14］。NLRP3激活的確切機制和它調節炎癥反應的機理，尚未研究透徹，但可能有多種調節機制和分子對NLRP3炎癥反應起積極或消極的調節作用。SCI使NLRP3激活產生促炎細胞因子會產生炎癥環境，從而加劇SCI的炎癥反應，從而惡化疾病的預后。

大量研究表明，中醫藥在治療SCI上有其獨特的經驗和優勢［15］。杜仲腰痛丸由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等組成，具有補益肝腎，通督脈、止痛消腫的功效。文獻研究表明服用杜仲腰痛丸后患者臨床癥狀明顯改善，血清IL-1、TNF-α的水平降低，IL-10水平升高，這表明杜仲腰痛丸有抗炎、緩解疼痛的作用［6］。

綜上所述，根據本實驗研究的結果，說明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，從而減輕脊髓損傷后繼發的炎癥反應，起到保護神經細胞的作用。但是具體的作用過程還未可知，是直接結合NLRP3炎性體從而抑制炎性反應，或者是通過其他途徑來影響NLRP3炎性小體的激活，其中原理還需要在以后的實驗研究中去探究證實。

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（收稿日期：2022-70-18）