木犀草素對肝星狀細胞活化和CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的抑制作用及機制研究

刁瑩,王仲娟,李敏

(蘇州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院,江蘇 蘇州 215123)

肝纖維化是肝臟組織周圍過度沉積大量膠原蛋白和纖維粘連蛋白等細胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc,ECM)所致,多種細胞及分子均參與纖維化的進程［1］.其中,肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cell,HSC)的激活是肝纖維化發(fā)展中的一個重要過程［2］.肝損傷會誘導(dǎo)HSC活化,導(dǎo)致其基因表達的改變,引起細胞增殖和遷移,同時HSC可轉(zhuǎn)化為表達大量a-平滑肌肌動蛋白(Smooth Muscle-alpha,α-SMA)的肌成纖維細胞,產(chǎn)生大量的膠原蛋白和其他ECM分子,并分泌促炎細胞因子等加重后續(xù)免疫細胞浸潤進而促進纖維化發(fā)生［3-4］.轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)是轉(zhuǎn)化生長因子家族的一員,這個家族的細胞因子對于細胞分化、增殖、凋亡和遷移有著廣泛的影響,也是一種重要的促纖維化信號因子,參與包括肝臟在內(nèi)的多種器官的纖維化形成的啟動和維持.TGF-β1特異性細胞表面受體具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,Smad家族的轉(zhuǎn)錄因子是TGF-β1受體激酶的直接底物,TGF-β1受體復(fù)合物被激活后,可誘導(dǎo)多個Smads蛋白的磷酸化［5］,因此尋找新的靶向TGF-β1/Smad通路天然化合物是當(dāng)前開發(fā)抗纖維化藥物的有效途徑之一.

木犀草素(Luteolin),全稱3,4,5,7-四羥基黃酮,是一種常見的黃酮類化合物,存在于多種植物中如藥草、水果和蔬菜［6］.富含木犀草素的植物在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)記載中認為可用于治療多種疾病,如炎癥性疾病、癌癥和高血壓［7］.現(xiàn)有研究顯示木犀草素除抗炎及抗癌活性外,也具有一定的抗氧化及自由基清除能力［8-10］.同時有臨床應(yīng)用研究也表明含有木犀草素和濃縮木犀草素提取液未發(fā)生顯著不良反應(yīng)［11］.目前有大量研究表明木犀草素對多種纖維化疾病,如腎臟、肺臟及肝纖維化均有保護作用,但其深入的分子調(diào)控機制值得探討.本實驗體外采用LX-2細胞為研究對象,體內(nèi)使用CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型,進一步明確木犀草素對肝纖維化的保護作用,并探討其對于LX-2中TGF-β1/Smad信號通路的影響并尋找其抗肝纖維化的其他可能調(diào)控機制,為木犀草素的臨床應(yīng)用提供部分科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

LX-2人肝星狀細胞系,由本實驗室保存.木犀草素購自上海源葉生物科技有限公司,蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、細胞裂解液、購自弗德生物科技有限公司.蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司,TGF-β購自Peprotech.體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶消化液和青鏈霉素購自美國HyClone,Collagen I、α-SMA、Smad2、p-Smad2、β-Actin和GADPH相關(guān)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司.

1.2 方法

1.2.1CCK-8增殖與細胞劃痕實驗

將LX-2細胞以每孔2×104個接種于96孔板中,或以每孔4×105個接種于6孔板中,同時將細胞分為4組,分別為對照組、TGF-β1(10 μg/L)刺激組,TGF-β1(10 μg/L)與木犀草素處理組(12.5、25 μmol/L),待細胞密度達80%左右,加入這些藥物處理48 h后以每孔20 μL CCK-8試劑加入96孔板,檢測OD450值;或用200 μL無菌槍頭在藥物處理之前于6孔板中均勻畫橫線,48 h后,對劃痕進行顯微鏡拍照.

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR與Western blot檢測

將LX-2細胞以每孔4×105個接種于6孔板中,同時將細胞分為4組,分別為對照組、TGF-β1(10 μg/L)刺激組,TGF-β1(10 μg/L)與木犀草素處理組(12.5、25 μmol/L),待細胞密度達80%左右,加入這些藥物處理24 h.Trizol法提取總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄處理.逆轉(zhuǎn)錄程序為:1)37 ℃,15 min;2)85 ℃,5 s.按熒光定量PCR試劑盒進行操作.熒光定量PCR反應(yīng)條件為:1)95 ℃,2 min;2)95 ℃,5s;3)60 ℃,34s;40個循環(huán).引物序列如下,CollagenⅠ:Forward 5′-ATTTTTCTGDCGACACCCGAT-3′,Reverse 5′-TCCCAGGTGTAGACCAA-3′;α-SMA:Forward 5′-ATTTTTGCCCGATACCCGAT-3′,Reverse 5′-TGACCGTCATAGACCAA-3′;β-Actin:Forward 5′-ATTTTTGTACACACAATGC-3′,Reverse 5′-TGACCGGTGTCCCTGACGAT-3′.

將LX-2細胞以每孔4×105個接種于6孔板中,分組同前,藥物處理24 h后加入RIPA裂解液(含有體積分?jǐn)?shù)1%蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min,高速離心機4 ℃,12 000 r/min離心15 min后吸取上層蛋白.蛋白定量完成后加上樣緩沖液,沸水煮10 min.電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜,隨后用脫脂牛奶進行封閉,PBST清洗,均為1∶1 000體積稀釋一抗(collgenI、α-SMA、Smad2、P-Smad2、β-Actin、GAPDH),4 ℃過夜.第2天用冷PBS清洗條帶3次,二抗孵育1 h,化學(xué)發(fā)光儀發(fā)光拍照.

1.2.3CCl4小鼠肝纖維化模型與天狼猩紅染色

C57小鼠分組,分為PBS組和木犀草素治療組,每組6只.CCl4和橄欖油(2∶3)按比例混勻,每周2次腹腔注射,每只小鼠注射100 μL,注射劑量3 mL/kg,連續(xù)注射6周.CCl4注射4周后,木犀草素組灌胃給藥100 mg/kg,每周3次給藥,連續(xù)給藥2周.2周后處死所有小鼠,取小鼠肝臟并固定在體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中.

中性甲醛液固定組織,石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水.天狼猩紅染色50 min.蒸餾水洗3次.梯度乙醇脫水.二甲苯透明,中性樹膠封固.染色的結(jié)果膠原呈紅色.

1.2.4質(zhì)譜樣本處理與檢測

將LX-2細胞以每孔4×105個接種于6孔板中,分為TGF-β1(10 μg/L)刺激組,TGF-β1(10 μg/L)與木犀草素(25 μmol/L)處理組,給藥處理24 h,將處理好的LX-2細胞進行收集,用預(yù)冷的PBS洗滌2遍.細胞中加入含8 mol/L尿素、1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液進行超聲裂解,離心取上清.向蛋白質(zhì)溶液中加入終濃度為5 mmol/L的DTT,60 ℃條件下孵育30 min進行還原.加入15 mmol/L的IAA烷基化.然后向上述體系中加入25 mmol/L的NH4HCO3溶液置換出尿素.將胰蛋白酶和蛋白按1∶50的質(zhì)量比加入胰酶,37 ℃酶切過夜.將10%TFA加入消化后的樣本中終止消化,BCA測蛋白濃度.將該樣品溶液過C18除鹽小柱后收集濾液,在離心濃縮儀中常溫旋干.

除鹽純化后的多肽樣品通過Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀進行檢測.設(shè)置質(zhì)譜檢測分析條件:陽離子采集模式;一級質(zhì)譜掃描分辨率為60 000;高能碰撞解離(HCD)設(shè)置為15;二級質(zhì)譜碰撞能量為30%.自動采集各多肽信息,獲得其二級譜圖.

1.2.5數(shù)據(jù)分析

將UniProt人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入Proteome Discoverer 2.2(Thermo Fisher)軟件中,將MS/MS圖譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫進行檢索,檢索方法參考文獻［13］,基于Label Free定量(LFQ)在軟件中表示為肽量化蛋白質(zhì)豐度,將木犀草素組與對照組均值之比≤0.5且P<0.05定義為蛋白表達量下調(diào).所有數(shù)據(jù)均經(jīng)GraphPad Prism 9軟件統(tǒng)計分析,組間比較用t檢驗.

2 結(jié) 果

2.1 木犀草素顯著抑制LX-2細胞的增殖

為了驗證木犀草素是否能影響肝星形細胞的增殖,選擇人肝星形細胞系LX-2作為研究對象,其具有肝星狀細胞的典型特點.CCK8實驗結(jié)果顯示(圖1):與未處理的對照組相比,10 μg/L TGF-β1處理可促進LX-2細胞增殖(P<0.05);而木犀草素可顯著抑制LX-2的增殖(P<0.05),且這種抑制作用具有劑量依賴性.

2.2 木犀草素可明顯抑制LX-2細胞遷移

圖2所示,木犀草素處理可顯著抑制LX-2的遷移,這提示木犀草素可通過影響LX-2遷移修復(fù)能力從而抑制纖維化進程.

2.3 木犀草素可明顯抑制α-SMA、Collagen I的mRNA水平表達

LX-2細胞活化后會明顯增加α-SMA及膠原的生成量,從而促進纖維化.為研究木犀草素對LX-2的活化有無影響,在TGF-β1刺激的條件下給予木犀草素處理LX-2細胞,提取細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達.結(jié)果如圖3所示,木犀草素處理可在mRNA水平下調(diào)LX-2細胞Collagen I和a-SMA表達.

2.4 木犀草素可抑制LX-2細胞N-cadherin、Collagen I、α-SMA蛋白表達及Smad2磷酸化

接下來為了進一步明確木犀草素對LX-2細胞轉(zhuǎn)分化以及釋放ECM等的影響,在蛋白水平上驗證了其對相關(guān)指標(biāo)的影響.如圖4(a,b)所示,與mRNA結(jié)果變化一致,木犀草素可明顯抑制Collagen I和a-SMA的蛋白表達,且具有劑量依賴性.考慮到Smads的磷酸化是TGF-下游激活的重要標(biāo)志,我們檢測了木犀草素對Smads磷酸化的影響.結(jié)果如圖4(c,d)所示,木犀草素顯著抑制了Smad2 Ser-465/467位點的磷酸化水平,這表明木犀草素很有可能是通過抑制TGF-β1/Smads信號通路來抑制LX-2的活化.此外,驗證了木犀草素對上皮轉(zhuǎn)分化的重要標(biāo)志物N-cadherin的表達影響,結(jié)果如圖5所示,木犀草素可明顯抑制N-cadherin的表達,這提示木犀草素也可通過抑制上皮轉(zhuǎn)分化來抑制細胞侵襲等來影響纖維化.

2.5 木犀草素可明顯延緩CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維肝組織的進程

使用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,進一步在體內(nèi)明確木犀草素對肝纖維化的保護作用.如圖6所示,天狼猩紅染色顯示正常組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)正常,僅在匯管區(qū)和中央靜脈有少量膠原纖維;CCl4建模組小鼠的肝組織中膠原纖維沉積,形成一個連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),浸潤肝實質(zhì),失去正常的小葉結(jié)構(gòu),可見明顯染色成紅色的纖維間隔;在CCl4建模4周后,給予木犀草素處理2周,明顯減少了小鼠肝組織的膠原纖維沉積,維持肝小葉結(jié)構(gòu)完整,提示木犀草素顯著延緩了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化進程.

2.6 木犀草素對下調(diào)差異表達蛋白的GO注釋分析及KEGG通路分析

用Orbitrap Fusion Lumos三合一超高分辨質(zhì)譜儀分析了木犀草素處理組與PBS處理組LX-2細胞所表達的蛋白差異,結(jié)果顯示兩組細胞中共鑒定出3 511個蛋白,其中有81個蛋白表達下調(diào).GO分析結(jié)果顯示,下調(diào)差異蛋白主要參與線粒體電子傳遞、氧化磷酸化、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)、血管生成和形態(tài)發(fā)生、ATP代謝過程、細胞骨架組織的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程;差異蛋白主要定位在基膜、線粒體膜間隙、高爾基體、胞質(zhì)囊腔和細胞外基質(zhì)等細胞器上;在分子功能方面,差異蛋白主要涉及氧化還原驅(qū)動活性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、電子轉(zhuǎn)移激活、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、激活結(jié)構(gòu)分子等活性(附圖Ⅰ).

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對下調(diào)差異表達蛋白進行通路富集分析,發(fā)現(xiàn)木犀草素處理組的差異蛋白主要涉及其中66條信號通路,包含Metabolic、ECM-receptor interaction、PI3K-Akt、Oxidative phosphorylation、AGE-RAGE、mTOR等信號通路(附圖Ⅱ).

3 討 論

肝纖維化是由病毒、酒精、自身免疫等多種原因引起肝細胞發(fā)生炎癥壞死,從而導(dǎo)致肝星狀細胞激活轉(zhuǎn)化、細胞外基質(zhì)的合成增加與降解減少而大量沉積在細胞間質(zhì)中形成的.有研究證明肝纖維化及肝硬化早期是可逆轉(zhuǎn)的,但后期進展為肝硬化終末期則不可逆轉(zhuǎn),甚至可能發(fā)展為肝癌［14］.肝纖維化是慢性肝病的重要環(huán)節(jié),嚴(yán)重威脅人類的健康,因而不斷尋找有效阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療方法迫在眉睫.肝纖維化發(fā)病機制的相關(guān)研究顯示肝星狀細胞的激活與轉(zhuǎn)化在肝臟纖維化中起著關(guān)鍵作用.而轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1,在肝臟纖維化形成的過程中起著非常重要的作用,其中TGF-β1/Smad信號通路則被認為是刺激HSC活化、增殖的關(guān)鍵信號通路［15］.因此,抑制TGF-β1信號通路是一種很有前景的抗纖維化方法.

木犀草素具有較強的抗氧化能力,自由基清除能力,抗炎作用和抗癌活性,但其抗纖維化作用及機制還未明確闡明［12,16］,但本研究認為木犀草素作為一個天然化合物,很可能還存在影響其他通路的分子機制.本研究表明木犀草素可以有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細胞的活化及CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化.實驗結(jié)果顯示木犀草素可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)后LX-2細胞的增殖,并抑制TGF-β1誘導(dǎo)后EMC成分CollagenI及α-SMA的mRNA和蛋白水平的表達,通過western blot顯示木犀草素抑制Smad2的ser465/467磷酸化位點的表達.天狼猩紅染色結(jié)果顯示木犀草素可以顯著改善CCl4誘導(dǎo)的肝組織學(xué)變化.說明木犀草素可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2的TGF-β1/Smad信號通路,從而抑制其纖維化水平.為進一步探討木犀草素參與肝纖維化的機制,本研究采用Orbitrap Fusion Lumos三合一超高分辨質(zhì)譜儀對兩組細胞蛋白進行了分析,共鑒定出3 511個蛋白,其中有81個蛋白表達下調(diào).差異表達的蛋白對抑制細胞纖維化無疑起到重要的作用.GO注釋和KEGG信號富集分析在生物信息學(xué)應(yīng)用中有重要的作用［17］.GO注釋表明下調(diào)差異蛋白主要參與線粒體電子傳遞、氧化磷酸化、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)、血管生成和形態(tài)發(fā)生、ATP代謝過程、細胞骨架組織的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程.KEGG通路分析下調(diào)差異蛋白主要參與了代謝途徑、多種神經(jīng)疾病、ECM與細胞的相互作用、氧化磷酸化、內(nèi)吞作用、PI3K-Akt、mTOR等信號通路.

綜上所述,本研究進一步明確了木犀草素對小鼠肝纖維化的保護作用,驗證了其可能通過木犀草素TGF-β1/smad2信號通路從而影響肝星形細胞活化釋放ECM以及抑制遷移、轉(zhuǎn)分化等幾個方面來肝纖維化.此外,通過質(zhì)譜組學(xué)分析提示木犀草素很可能還通過影響代謝等多種通路調(diào)節(jié)肝纖維化,而闡明其中可能的機制對木犀草素的臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義.

作者貢獻：刁瑩和王仲娟為共同第一作者.

附 錄

附圖Ⅰ、Ⅱ見電子版(DOI:10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.05.016).