奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗
——以甘肅天水為例

郭朝剛

甘肅省天水市麥積區畜牧獸醫事務服務中心，甘肅天水 741020

0 引言

乳房炎是奶牛較為常見疾病之一。全球將近40%奶牛患有乳房炎，而我國的發病率更接近70%，是一種發病率高且較難預防和治療的疾病。奶牛患有乳房炎后，會影響乳腺的泌乳功能，導致產奶量降低，乳質量降低[1]，如不及時治療，還會引發奶牛全身系統疾病，增加治療周期和治療成本，給牧場造成更多的經濟損失[2]。引起奶牛乳房炎以大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌最為常見，占90%以上。其中大腸桿菌分離率高，入侵奶牛乳房后能迅速產生內毒素，且具極強的耐藥性，為乳房炎治療帶來很大挑戰[3]。

甘肅是農業大省，奶牛養殖業是重要的農業產業。甘肅的奶牛養殖業主要集中在蘭州、天水、平涼、隴南等地，經過常年的發展，正在逐漸改變以往傳統的養殖方式，更加注重科學、規范和高效，但奶牛乳房炎仍是困擾發展的難題，發病率在25%以上[4]。本研究采集甘肅天水3 個奶牛場患有臨床乳房炎奶牛乳樣，進行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗，為當地防控乳房炎提供參考。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

2022年10—12月選取甘肅天水3 個規模化奶牛場40 頭患有臨床乳房炎的奶牛作為研究對象，奶牛具體表現為對乳區觸碰反應敏感，乳房紅腫、發熱及乳汁中有血絲和凝塊現象。共120 份奶牛乳房炎乳樣，每頭牛各乳區的乳樣均作為獨立樣本，不可混采。

1.2 主要試劑及儀器

CAMHBT營養肉湯、MH培養基、甘露醇氯化鈉培養基、水解酪蛋白肉湯培養基、麥康凱培養基、SS培養基、血瓊脂平板、革蘭氏染液、LB肉湯培養基、革蘭氏陰性菌鑒定板、革蘭氏陰性菌藥敏板，美國賽默飛公司；恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑啉、氧氟沙星、頭孢噻呋、慶大霉素、環丙沙星、阿奇霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、多西環素、土霉素、頭孢氨芐、四環素、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺異唑等抗菌藥物標準品，中國獸醫藥品監察所。

梅里埃全自動細菌鑒定儀、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋，嘉興中新醫療儀器有限公司；超凈臺，美國賽默飛公司。

2 試驗方法

2.1 樣品采集

對奶牛乳區消毒后，棄去頭3 把奶，每個乳區收集10 mL乳樣，置于無菌離心管中于4 ℃保溫盒中，送至中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所實驗室進行病原菌的分離鑒定。

2.2 病原菌的分離和鑒定

采集2 mL乳樣分別涂抹接種在甘露醇氯化鈉培養基、血瓊脂平板、麥康凱培養基、SS培養基中，置37 ℃恒溫箱中培養24 h后，選擇有特定顏色、形狀、光澤的菌落。其中，甘露醇氯化鈉培養基中選擇金黃色、圓形菌落；血瓊脂平板中選擇具有溶血環、圓形、暗金屬光澤的小菌落；麥康凱培養基中選取圓形、紅色金屬光澤菌落；SS培養基中選取圓形、黑色金屬光澤菌落。

將4 種培養基中選取的菌落用平板劃線法增殖培養，純化后進行將菌液加入梅里埃全自動細菌鑒定儀中進行細菌鑒定[5]。

2.3 體外藥物敏感試驗

2.3.1 菌液制備

使用接種環在LB肉湯培養基中挑選復活的大腸桿菌樣本，并在37 ℃環境中進行6～8 h復蘇培養。為確保單菌落活性，在血瓊脂平板上繼續進行37 ℃的6～8 h培養。經過鏡檢后，使用無菌棉簽將菌落提取并置入水解酪蛋白肉湯培養基中進行稀釋，使其達到1.5×108CFU/mL，儲存備用。

2.3.2 藥敏試驗

采用Kirby-Bauer紙片擴散法對大腸桿菌進行藥敏試驗[6]。從高壓滅菌的棉簽中獲取菌液濃度為1.5×108CFU/mL的大腸桿菌菌液。在經過滅菌的空心管中通過擠壓去除多余菌液，然后輕輕涂抹到MH培養基的表面上。將平皿置于超純工作臺中靜止2～3 min，使表面菌液變干。用經過滅菌的鑷子將藥敏紙片輕輕壓實到平皿表面上。每個平皿上放置5 種不同藥敏紙片，每個菌株3 個平行樣本。將平皿置于37 ℃培養箱內培養18～24 h。最后用游標卡尺測量抑菌圈的直徑并記錄結果。按照美國臨床試驗標準，大腸桿菌對各種藥物的耐藥性及敏感性都根據紙片抑菌圈直徑判定，標準如表1所示，分別有耐藥、中介和敏感3 個等級。此外，藥敏試驗出現耐藥或中介2 個等級均可判斷大腸桿菌耐藥。

表2 乳房炎病原菌分離、鑒定結果

3 試驗結果

3.1 病原菌分離、鑒定結果

成功分離出140 個菌株，9 種不同的病原菌（表2）。大腸桿菌45 株，產氣腸桿菌2 株，金黃色葡萄球菌38 株，表皮葡萄球菌8 株，腐生葡萄球菌4 株，無乳鏈球菌20 株，乳房鏈球菌12 株，停乳鏈球菌10株、沙門氏菌1 株。其中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的數量最多，分別占32.1%、27.1%和14.3%。

3.2 大腸桿菌藥敏試驗結果

通過Kirby-Bauer紙片擴散法測定不同抗菌藥物對大腸桿菌的影響程度（表3）。45 株大腸桿菌受試菌株中有45 株對青霉素耐藥，耐藥率高達100%，而大腸桿菌對萬古霉素的敏感性最高，45株菌株中未檢測到耐藥性。此外，氧氟沙星、環丙沙星、氯霉素對大腸桿菌敏感率均為95.6%；卡那霉素對大腸桿菌敏感率為86.7%；氨芐西林和四環素對大腸桿菌敏感率為55.6%；紅霉素對大腸桿菌敏感率為44.4%。

表3 大腸桿菌藥敏試驗結果

4 分析與討論

4.1 奶牛乳房炎病原菌分離鑒定

奶牛乳房炎一般為多種病原菌混合感染導致，常見主要有20 多種。病原菌分離常見的有培養基分離法、抗生素敏感法及菌落膜法，其中培養基分離法和抗生素敏感法較常用。

本試驗采用培養基分離法。其基于生物學培養原理，即每種病原菌在不同培養基中生長情況不同，具有特定顏色、形狀、光澤，因此通過對不同培養基中菌落進行選擇可分離出不同菌株，該方法易實現，不需復雜技術，且通過對不同培養基進行分離可獲得較多菌株，從而提高分離效率。但需指出的是，該方法不能保證分離出所有病原菌，會有遺漏，且對病原菌判定只基于菌落外觀特征，而不是通過其生物學特性或基因組等信息，因此還需進一步鑒定。

對病原菌進行鑒定的方法有生化反應鑒定、染色鑒定、生物學鑒定等。染色鑒定通常使用各種染色液，對分離出的病原菌進行染色，觀察菌絲形狀、顏色、結構等特征以確定病原菌種類，這種方法簡便易行，不需高技術人員，但染色效果不穩定，容易出現誤診。生物學鑒定通常使用生物學試劑盒，對分離出的病原菌進行生物學試驗，如酶活性試驗、吸納試驗等，以確定病原菌種類，這種方法鑒定結果準確，但復雜、耗時。本試驗使用生化反應鑒定，即使用梅里埃全自動細菌鑒定儀，對分離出的病原菌進行生化反應，如代謝特征、酶特征、吸納特征等，以確定病原菌種類，這種方法簡便、快速，鑒定結果準確。

據研究，不同地區引起奶牛乳房炎的病原菌種類及比例都有區別。新疆地區大腸桿菌的檢出率最高，占20.9%，而無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的檢出率分別為14.6%和14.5%；吉林地區大腸桿菌的檢出率最高，為34.5%，其次為無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，檢出率分別為23.0%和11.8%[7]。各地區結果不一致的主要原因是地理環境、氣候不同，而同一地區奶牛場由于衛生環境、飼養技術、管理規范制度不同也可能導致病原菌種類出現差異。

4.2 大腸桿菌藥敏試驗

大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌之一，給奶牛養殖業造成很大經濟損失。目前針對奶牛乳房炎的臨床用藥主要有：青霉素類、四環素類、頭孢菌素類以及磺胺類。近年由于缺乏合理用藥意識，盲目使用及隨意加大劑量使用，導致耐藥菌越來越多，耐藥譜越來越寬，為臨床中奶牛乳房炎治療增添更多困難。研究報道，在新疆地區奶牛乳房炎中大腸桿菌對青霉素和紅霉素的耐藥率較高，分別為95.2%和90.5%，使這兩種藥幾乎無效；遼寧地區奶牛中大腸桿菌對青霉素嚴重耐藥，耐藥率高達99.2%，對紅霉素、四環素和氨芐西林的耐藥率相對較高，在47%～90%[8]。綜上研究可發現，由于日常用藥習慣，不論什么地區，常用藥物如青霉素，紅霉素，四環素的效果越來越差。本試驗耐藥性結果與其他地區結果相接近，大腸桿菌對青霉素耐藥率較高；四環素、紅霉素和氨芐西林的耐藥率在22.2%左右，而萬古霉素的耐藥性幾乎沒有。分析原因是青霉素、紅霉素、四環素知名度高且相對便宜，各大奶牛場都選擇這類藥物進行乳房炎治療，而萬古霉素一方面是成本更高，另外雖然抗菌譜更廣，可治療更多種細菌感染，但副作用相對更嚴重，因此實際應用中會更謹慎選擇萬古霉素和卡那霉素治療常見奶牛乳房炎疾病。

最后應當指出的是，不同地區奶牛場的奶牛，對不同抗菌藥物的耐藥性差別影響到實際藥物療效。Kirby-Bauer紙片擴散法主要測定大腸桿菌等細菌的耐藥性，其原理是在特定培養基上涂抹大腸桿菌樣本，再在上面放置抗生素紙片，最后觀察細菌生長情況，以此判斷細菌對抗生素的耐藥性。該方法簡單易行無需復雜設備，成本較低且能快速準確測定大腸桿菌的耐藥性，適合各大奶牛場在選擇藥物前進行簡單的藥敏試驗診斷，并根據結果選擇最合適的抗菌藥物，制定合理用藥方案。