牛支原體滅活疫苗免疫小鼠最小免疫劑量及抗體消長規律研究

王超麗，吳 潔，任靜靜，萬 姣，楊銘偉

1 石河子獸醫協會，新疆石河子 832000

2 第八師畜牧獸醫工作站，新疆石河子 832000

3 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000

0 引言

牛支原體（Mycoplasma Bovis）是引起犢牛肺炎、關節炎和成年牛乳房炎的主要病原體之一。1961年，牛支原體被鑒定為致乳腺炎的病原體，1976年首次被描述為引起呼吸道疾病的病因[1]，此后在不同國家與地區相繼暴發與流行，給世界養牛業帶來巨大經濟損失。目前已證實，牛支原體除導致牛肺炎、乳腺炎外，還可導致關節炎、角膜結膜炎、耳炎、生殖道炎、流產與不孕等多種疾病[2，3]。牛支原體多數由于存在與其他病原體的混合感染，對多種抗生素表現耐藥性，導致抗生素的治療效果產生偏差[4]，因此應用疫苗進行免疫預防便成為控制牛支原體病的主要措施。但目前除美國外，幾乎無商品化疫苗應用于牛支原體病的預防，還沒有文獻報道牛支原體病可以使用疫苗進行預防控制[5]。

1 試驗材料

1.1 試驗菌株及試驗動物

牛支原體新疆分離株，2010年分離自新疆石河子某牛場因肺炎死亡犢牛肺臟組織，參照文獻[6]的方法對其進行特異性PCR鑒定和oppF基因測序分析，鑒定為牛支原體；試驗用小鼠，石河子大學實驗動物中心。

1.2 主要儀器設備及試劑

ISA206雙相佐劑，法國賽比克公司；光學顯微鏡CX21，日本奧林巴斯公司；高速冷凍離心機CR22E，美國西格瑪奧德里奇公；生物安全柜BHC-Ⅱ-A/B3型，拓赫機電科技(上海)有限公司；連續波長酶標儀，美國伯樂公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG，史瑞克生物（上海）有限公司。

1.3 ELISA檢測相關試劑

鼠抗牛支原體陽性高免血清由免疫學實驗室制備；鼠抗牛支原體陰性血清為未免疫牛支原體疫苗，抗體檢測為陰性的健康小鼠血清。

2.5%戊二醛溶液：0.1 mol/L碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液90 mL，25%戊二醛10 mL。

抗原包被液（0.05 mol/L Na2CO3和NaHCO3緩沖液，pH值=9.6）：Na2CO31.5 g，KCl 0.2 g，NaHCO32.9 g，ddH2O定容至1 L，調整 pH值=9.6。

PBST洗滌液（pH值=7.4）：NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，K2HPO40.2 g，吐溫-20 0.5 mL，加ddH2O定容至1 L，現用現配。

封閉液（樣品稀釋液）：PBS為介質的2%BSA溶液，振蕩混勻，4 ℃保存。

終止液（2 mol/L硫酸）：濃硫酸22.2 mL，ddH2O177.8 mL。

PBS緩沖液（pH值=7.4）：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，K2HPO40.2g，加ddH2O定容至1 L，調整pH值=7.4。

底物溶液：0.1 mol/L檸檬酸緩沖液5.6 mL，0.2 mol/L 磷酸氫二鈉緩沖液4.4 mL，10 mg/mL四甲基聯苯胺（用DMSO二甲基亞砜配制）100 μL，0.75%H2O242 μL，臨用前配制。

2 方法

2.1 抗原制備

將-80 ℃凍存的牛支原體菌株移入5 mL的牛支原體專用液體擴大培養基中，37 ℃、5%CO2箱中培養3 d，后按照體積比1∶10的比例傳代3 次，待生長穩定后作為種子菌液。按照體積比1∶10接種新鮮培養基，置于37 ℃、5%CO2箱中擴大培養4 d，作為牛支原體抗原菌懸液。

2.2 牛支原體滅活疫苗的制備

2.2.1 疫苗配制

ISA206雙相佐劑∶抗原菌懸液= 54∶46（V/V）。佐劑使用前需經121 ℃高壓滅菌30 min。配苗前將佐劑和抗原菌懸液預熱至（31±1）℃；在150 r/min攪拌狀態下將抗原菌懸液緩慢滴入佐劑中，滴加完畢后，置恒溫震蕩培養箱30 ℃ 200 r/min，循環乳化 30 min，取出后置-20 ℃10 min迅速降溫，冷卻后4 ℃保存。

2.2.2 檢測指標

無菌檢測：在無菌狀態下將乳化后的疫苗分別接種于普通營養瓊脂培養基和鮮血瓊脂培養基，在37 ℃、5%CO2箱中培養4～5 d，觀察有無雜菌生長。

黏度檢測：用出口內徑為1.2 mm的1 mL刻度吸管吸取室溫下雙相疫苗，然后垂直懸空吸管使疫苗乳劑自然流出，記錄流出0.4 mL乳劑所用時間。

離心檢測：用10 mL刻度離心管吸取雙相疫苗10 mL，以3 000 r/min 離心15 min，觀察其分層情況。

劑型檢測：顯微鏡400 倍下觀察雙相疫苗的均勻度，第1滴下部成拖尾云霧狀或部分散為水/油/水（W/O/W）。

穩定性試驗：疫苗分別存放于4 ℃、37 ℃、-20 ℃環境中，在第3 d、7 d、30 d、90 d、180 d、365 d觀察疫苗穩定性。

安全性試驗：小白鼠每只腹腔注射0.2 mL，家兔每只皮下注射1 mL，觀察其精神狀態及采食狀況。

2.3 最小免疫劑量試驗

取60 只健康小鼠，按15 只/組隨機分為A、B、C、D 組，進行免疫。A、B、C、D 組通過腿部肌肉接種牛支原體滅活疫苗，注射劑量分別為：0.1 mL/只、0.2 mL/只、0.3 mL/只、0.4 mL/只。E 組為空白對照組，為5 只健康小鼠。試驗組共免疫2 次，首免10 d后以同樣劑量補充免疫1 次，二免后第14 d、21 d分別采血，分離收集血清，-20 ℃保存待檢。

2.4 免疫持續期試驗

20 只健康小鼠通過腿部肌肉接種牛支原體滅活疫苗，0.2 mL/只，共免疫2 次。另設5 只健康小鼠為空白對照組。試驗組：首免10 d后以同樣劑量補充免疫1 次，二免后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d分別采血，分離收集血清，-20 ℃保存待檢。

2.5 ELISA檢測血清抗體滴度

2.5.1 酶標板預處理

酶標板中加入2.5%戊二醛溶液150 μL/孔，37 ℃2～3 h，去離子水洗滌3 次，每次5 min。

2.5.2 抗原包被及封閉

用抗原包被液將上述2.1制備的抗原菌懸液稀釋至270 μg/mL后包被酶標板，100 μL孔，4 ℃包被過夜；次日棄去孔中液體，用PBST洗滌液洗板4 次，每次5 min，拍干，加入封閉液200 μL/孔，37 ℃封閉3 h。

2.5.3 加入待檢血清

棄去孔中液體，以同樣方法洗板，將待檢血清稀釋100 倍，加入封閉好的酶標板中，100 μL/孔，同時設立陰性和陽性對照孔，置于37 ℃孵育1 h。

2.5.4 加入酶標二抗

棄去孔中液體，以同樣方法洗板，加入1∶1 000倍稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h。

2.5.5 顯色

棄去孔中液體，用PBST洗滌液洗板4 次，每孔加入100 μL新鮮配制的底物溶液，37 ℃避光顯色15 min，取出后立即加入終止液50 μL/孔終止反應，并迅速于450 nm波長測OD值。

3 結果

3.1 疫苗最小免疫劑量

小鼠免疫牛支原體滅活疫苗后，血清中抗體滴度明顯高于未免疫組，但0.2 mL組抗體滴度最高，因此選取0.2 mL小鼠免疫牛支原體滅活疫苗的最小免疫劑量。不同免疫劑量免疫小鼠后平均抗體滴度詳見表1。

表1 疫苗免疫后第14 d、21 d平均抗體滴度

3.2 疫苗免疫后抗體消長規律測定

牛支原體滅活疫苗免疫小鼠3 周后，抗體滴度達最高峰，隨后抗體滴度開始下降，但仍保持相對穩定，5 周后抗體滴度呈下降趨勢。牛支原體滅活疫苗免疫小鼠后平均抗體消長規律詳見表2。

表2 牛支原體滅活疫苗免疫小鼠后平均抗體滴度（OD450）消長規律表

4 討論

研究發現，藥物對支原體類疾病治療僅可使臨床癥狀減輕或消失，停藥后病情會反復，很難徹底治愈和根除，所以控制支原體病的最有效措施是免疫接種[7]。但目前尚無商品化牛支原體疫苗，牛支原體病的防控形勢較嚴峻。本研究就課題組制備的牛支原體滅活疫苗對小鼠進行免疫試驗，發現接種后小鼠未見異常反應，且接種部位均正常，未見化膿及紅腫現象，表明疫苗安全可靠。

影響疫苗免疫效果的因素眾多，在保證疫苗免疫原性的前提下，免疫劑量及次數是影響機體免疫應答反應的主要因素之一，尤以滅活疫苗最明顯。免疫劑量不足、有效抗原量過小均不能有效誘導機體產生免疫應答，抗體滴度不高且持續時間短暫；免疫劑量過大可誘使機體產生免疫麻痹現象或變態反應，不但起不到預期免疫效果，相反還可能會給動物機體造成損傷。本研究設4 個劑量組對小鼠進行免疫試驗，結果表明0.2 mL組產生的免疫反應優于其他3 個劑量組，抗體滴度最高，免疫后14 d平均抗體滴度為0.324，免疫后21 d平均抗體滴度為0.378，可能0.1 mL組抗原量不足，不能誘導機體產生較好免疫應答反應，而0.3 mL與0.4 mL組可能免疫劑量過大，導致機體出現麻痹現象；選取0.2 mL作為最佳免疫劑量免疫小鼠，免疫后進行抗體水平檢測，結果表明試驗組與對照組差異顯著，試驗組在免疫后抗體水平明顯上升，且高抗體水平可持續30 d左右。試驗結果為牛支原體滅活疫苗應用提供一定的科學依據。