酸性蛋白復合酶提取大棗多糖方法研究

鄭靜美，閆婧怡，王軍華，王 蓓，孫博研

（河北瑞龍生物科技有限公司，河北 石家莊 050000）

0 引 言

棗為薔薇目鼠李科棗屬植物，在中國已有長達8000 多年的種植歷史，被列為“五果”之一，棗中富含多糖、蛋白質、脂肪、糖類、胡蘿卜素、維生素等營養成分，現已廣泛種植。近年來我國對多糖在醫藥領域中的應用研究很快，研究范圍廣，涉及理化性質、應用等。大棗多糖結構復雜，具有重要的生理保健功能和生物活性，可有效的清除體內的自由基，具有抗衰老、抗癌癥、抗病毒等多種生理活性。

對于大棗多糖的提取研究較多,包括傳統的水提法、溶劑萃取法等，均存在一些問題，水提法由于溫度較高會導致大棗多糖活性變差，且需要多次反復操作，需要較長的操作周期，溶劑萃取法雖應用廣泛，但每次提取均需新鮮溶劑用于提供較大的溶解能力，每次循環時間長，不適于高沸點溶劑，且存在溶劑回收難、有殘留等問題。隨著科學技術的發展，近年來也出現了一些新的提取方法和設備，包括：超臨界CO2萃取、分子篩分離法，膜分離集成技術等，但存在設備成本高等缺點。目前，有研究采用酶法提取大棗多糖。酶制劑的品種繁多，且功效不一，由于酶制劑具有專一性、催化效率高，不發生副反應，且不需要高溫、高壓、強酸、強堿等條件，反應溫和，且反應產物無毒。針對大棗多糖細胞壁厚、細胞粗大，且含有一定量的蛋白質的情況，需有針對性的選取合適的酶制劑，加速大棗多糖從細胞中的擴散速率，縮短大棗多糖的提取時間。石奇等人研究了中性蛋白酶提取大棗多糖，楊輝等人研究了果膠酶提取大棗多糖的工藝。本研究選用復合酶做為提取大棗多糖的酶制劑，相較于單一的酶制劑減低了成本，并能發揮復合酶的協同作用。通過對酶制劑的篩選，確定了酸性蛋白復合酶做為大棗多糖提取的酶制劑，并通過單因素試驗及正交試驗優化了酸性蛋白復合酶液提取大棗多糖的工藝，為大棗多糖的加工及應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

大棗購于石家莊農貿市場，將大棗篩選后去核、干燥后粉碎，得到干燥棗粉。果膠復合酶液、纖維素復合酶液、酸性蛋白酶液均購自廣西南寧東恒華道生物科技有限公司，其中果膠復合酶液中含有少量半纖維素酶及淀粉酶，纖維素復合酶液中含有少量半纖維素酶及果膠酶，酸性蛋白酶液中含有少量果膠酶及淀粉酶。

1.2 試 劑

試驗中所用試劑見表1。

表1 試驗中所用試劑Table 1 Reagents used in the experiment

1.3 儀器與設備

試驗中所用儀器設備見表2。

表2 試驗中所用儀器Table 2 Instruments used in the test

1.4 實驗方法

1.4.1 復合酶制劑篩選

稱量干燥棗粉4 份100 克，分別加入1000g水，分別添加底物濃度為1%的果膠酶復合酶液、1%的酸性蛋白復合酶液、1%的纖維素復合酶液，調節溶液pH，將添加果膠酶復合酶液及纖維素復合酶液的溶液pH 調節至7，將添加酸性蛋白復合酶液的溶液pH 調節至4.2，于40 ℃下提取120 min。離心后取上清液，濃縮，加入無水乙醇進行醇沉，離心后去上清液，將沉淀層多糖進行干燥，干燥后復溶，采用三氯乙酸脫蛋白，向脫蛋白后的溶液中加入雙氧水進行脫色反應。脫色后濃縮，醇沉后離心去上清，將沉淀層多糖干燥后得到多糖。實驗進行3 次取平均值，篩選出適宜的復合酶制劑。

1.4.2 加酶濃度對大棗多糖提取含量和得率的影響

稱量干燥棗粉5 份各100 克，分別加入1000g水，分別添加底物濃度為0.2%、0.5%、1.0%、1.2%、1.5%的酸性蛋白復合酶液，調節溶液pH 值至4.2，于40 攝氏度下提取120min。后續步驟與1.4.1 相同。實驗進行3 次取平均值，篩選出適宜的酸性蛋白復合酶添加濃度。

1.4.3 提取時間對大棗多糖提取含量及得率的影響

稱量干燥棗粉6 份各100 克，分別加入1000g 水，添加底物濃度為1.0%的酸性蛋白復合酶液。調節溶液pH 值至4.2，溶液溫度40℃，提取時間分別設置40min、 60min、 100min、120min、140min、160min。后續步驟與1.4.1 相同。實驗進行3 次取平均值，篩選出適宜的提取時間。

1.4.4 提取溫度對大棗多糖含量和得率的的影響

稱量干燥棗粉5 份各100 克，分別入1000g水，添加底物濃度為1.0%的酸性蛋白復合酶液。調節溶液pH 值為4.2，溶液溫度分別設置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，提取時間120min。后續步驟與1.4.1 相同。實驗進行3 次取平均值，篩選出適宜的提取溫度。

1.4.5 溶液pH 值對大棗多糖提取含量和得率的影響

稱量干燥棗粉5 份各100 克，分別入1000g水，酸性蛋白復合酶液添加量為濃度1%。溶液pH 值分別調節至2.2、3.2、4.2、5.2、7.0，溶液溫度50℃，提取時間120min。后續步驟與1.4.1相同。實驗進行3 次取平均值，篩選出適宜的反應pH 值。

1.4.6 正交試驗設計

根據單因素篩選出的實驗結果，利用正交分析法設計酸性蛋白復合酶提取大棗多糖的實驗方法，選取pH 值、酶添加量、溫度、提取時間作為影響大棗多糖提取優化因素，設計L9(34)正交表，優化工藝參數，評估各單因素對發酵物中李子多酚含量影響的主次作用，確認最佳工藝條件。

自變量選用pH 值、酶添加量、溫度、提取時間，分別用A、B、C 和D 表示，用1、2、3 分別代表3 個水平，正交試驗因素水平表見表3。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Factor level table of orthogonal test

2 結果與分析

2.1 不同酶制劑對大棗多糖得率、含量影響

不同復合酶制劑處理后大棗多糖的得率和含量如圖1 所示。以去離子水組為參照，采用果膠復合酶液處理后大棗多糖含量均較去離子水組有所下降，經纖維素復合酶、酸性蛋白復合酶液處理后大棗多糖含量均較去離子水組有所增加；采用纖維素復合酶液處理后大棗多糖提取率較去離子水組有所下降，果膠復合酶液、酸性蛋白復合酶液處理后大棗多糖提取率有所增加；以大棗多糖的得率和含量為條件進行綜合判定，得出酸性蛋白復合酶液參與提取大棗多糖效果較好。因此，選取酸性蛋白復合酶液用于后續試驗。

圖1 不同酶制劑對大棗多糖得率、含量影響Fig.1 Effect of different enzyme preparations on the yield and content of jujube polysaccharides

2.2 酸性蛋白復合酶提取大棗多糖單因素試驗研究

2.2.1 酸性蛋白復合酶液的添加量對大棗多糖提取含量和得率的影響

酸性蛋白復合酶液的添加量對大棗多糖提取含量和得率的影響如圖2 所示，分析不同酸性蛋白復合酶液添加量下大棗多糖得率，可得當其添加量在0.2%～0.5%之間，大棗多糖得率有明顯增加，但隨著酸性蛋白復合酶液添加量的增加，大棗多糖得率急劇下降，達到1.5%時，得率幾乎為零，因此，為了得到較多的大棗多糖，酸性蛋白復合酶液的在添加量為1.0%～1.2%時較為適宜。同時大棗多糖的含量隨著酶添加量的增加有所增加，但當添加量超過1.2%以后，大棗多糖含量呈現下降趨勢。綜合以上實驗結論，再結合成本，可以得出，酶制劑的添加量在1.0%～1.2%之間獲得的大棗多糖無論是含量還是得率均最佳且成本最低。

圖2 酶制劑添加量對多糖含量和多糖得率的影響實驗圖Fig.2 Experimental diagram of the effect of enzyme addition on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.2 提取時間對大棗多糖提取含量及得率的影響

提取時間對大棗多糖提取含量和得率的影響如圖3 所示。隨著提取時間的增加，大棗多糖得率呈上升的趨勢，且在60 min 時大棗多糖得率增長速率最大。當提取時間超過120 min，大棗多糖得率隨著時間變化不明顯。隨著提取時間的延長，大棗多糖含量也呈上升趨勢，但當提取時間超過140 min 后，大棗多糖的含量下降很快。綜合大棗多糖得率和含量的試驗結果，得出提取時間在120 min左右時最為合適。

圖3 提取時間對多糖含量和多糖得率的影響實驗圖Fig.3 Experimental graph of the effect of extraction time on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.3 提取溫度對大棗多糖含量和得率的的影響

提取溫度對大棗多糖提取含量和得率的影響如圖4 所示。隨著提取溫度的升高，大棗多糖得率和含量都呈現出上升的趨勢，且在50 ℃時，大棗多糖得率和含量的增長速率均最大，50 ℃以后，不論是大棗多糖的含量還是得率都呈現出下降趨勢，因此，50 ℃為酸性蛋白復合酶制劑最適宜的反應溫度。

圖4 提取溫度對多糖含量和多糖得率的影響實驗圖Fig.4 Experimental graph of the effect of extraction temperature on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.4 溶液pH 值對大棗多糖提取含量和得率的影響

溶液pH 對大棗多糖提取含量和得率的影響如圖5 所示，當溶液pH 在2.2-3.2 之間時，大棗多糖得率和含量都呈上升的趨勢，當溶液pH 值超過3.2 后，大棗多糖得率和含量都呈下降的趨勢，因此，當溶液pH 為3.2 時為酸性蛋白復合酶液最佳反應pH。

圖5 溶液pH對多糖含量和多糖得率的影響實驗圖Fig.5 Experimental graph of the effect of solution pH on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.3 酸性蛋白復合酶提取大棗最佳提取條件正交試驗

根據試驗設計得出的試驗結果見表4。

表4 正交試驗設計與數據分析Table 4 Orthogonal experimental design and data analysis

通過表4 的正交試驗結果，綜合大棗多糖含量及多糖得率綜合評估，可以得出酸性蛋白復合酶液提取大棗多糖最佳工藝條件是：酸性蛋白復合酶液的添加量為1.0%，反應溫度40℃，溶液pH 值為3.2，提取時間為120min，在此條件下，大棗多糖的含量為41.93%，得率為4.9%。

3 結 語

本研究以大棗做為試驗原料，充分利用生物酶技術，通過添加復合酶制劑有效分解大棗組織，加速大棗多糖釋放，提高提取率，保證大棗多糖提取率及得率的最大化地的同時不破壞大棗多糖的生物活性；充分總結傳統大棗多糖的提取利用單一酶源成本高、提取率低、不適宜大規模工藝生產的弊端，通過比較果膠酶復合酶液、酸性蛋白復合酶液及纖維素復合酶液，篩選出適宜大棗多糖提取的酸性蛋白復合酶液做為大棗多糖提取的酶制劑，利用單因素試驗，通過優化酸性蛋白復合酶液的添加量、反應時間、反應溫度及溶液pH 提高酸性蛋白復合酶液提取大棗多糖的含量，進一步通過正交試驗優化反應結果,得到了酸性蛋白復合酶液提取大棗多糖的最佳工藝條件：在40℃的條件下，調節溶液pH 至3.2，酸性蛋白的添加量為1%，在此條件下提取2 h 后，大棗多糖的含量可達41.93%，得率可達4.9%。