人參皂苷Rg3對大鼠實驗性脈絡膜新生血管的影響及作用機制研究

褚文麗，亢澤峰，李書嬌，侯昕玥，陳水齡

脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是眼內新生血管的一種常見表現形式，指來自脈絡膜毛細血管的新生血管病理性增生并穿過Bruch 膜向內發展，進入視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）層，或視網膜感覺神經層與RPE 層之間[1]。CNV 是濕性年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）的主要病理改變，因其血管通透性高，易引起黃斑部反復出血、滲出、瘢痕形成，從而導致中心視力嚴重下降，甚至失明[2]。CNV 的發生發展是多細胞、多信號通路協同參與的復雜過程，其中低氧環境誘發的缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）相關信號通路的級聯反應，是最終導致CNV 形成的核心通路之一[3]。中藥單體人參皂苷Rg3 具有抗新生血管的藥理作用，近年被應用于眼部新生血管性疾病的研究[4]。本研究通過532 nm 激光誘導建立大鼠CNV 模型，予以人參皂苷Rg3 干預，觀察其對實驗性CNV進展的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7～8 周齡雄性SPF 級BN 大鼠36 只（36 只眼），體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK（京）2021-0006]，飼養于中國中醫科學院眼科醫院動物房，維持（25±2）℃恒溫，自由進食飲水。本研究實驗動物及實驗所用條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》相關規定。

1.2 藥品、試劑與儀器

參一膠囊（吉林亞泰制藥股份有限公司，國藥準字Z20030044，110804-201504），康柏西普眼用注射液（成都康弘藥業集團股份有限公司，S20130012），兔抗血管內皮生長因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）抗體、兔抗HIF-1α抗體（美國Abcam 公司，1316、2185），cDNA 第一鏈合成試劑盒（美國Thermo Scientific 公司，K1622）。532 nm 倍頻Nd YAG 激光治療機（德國LuMenis 公司，Novus Spectra），共聚焦激光眼底血管造影儀（德國Heidelberg公司，HRA2-TSP-00666），微量注射器（瑞士Hamilton 公司，1700），全自動熒光定量PCR儀（美國ABI公司，7500）。

1.3 激光光凝建立大鼠CNV模型

大鼠均選右眼為實驗眼，在裂隙燈下用532 nm倍頻Nd YAG激光治療機圍繞視盤并在距視盤1.5～2.0 視盤直徑（papillary diameter，PD）位置等距離光凝10個點，激光光凝參數：波長532 nm，功率300 mW，光斑直徑50 μm，爆破時間為0.05 s，當看到有氣泡產生時，提示Bruch膜被擊穿，作為有效點。

1.4 分組與給藥

參一膠囊由人參皂苷Rg3 單一活性成分組成，故將參一膠囊內容物粉末溶于蒸餾水中配置人參皂苷Rg3藥液。按照臨床等效劑量計算，配置3.65、7.20、14.40 mg/kg3 個劑量，灌胃前加熱至適溫，以4 ℃保存。

將造模成功的30 只大鼠隨機分為5 組，包括模型組（model group，MG）、人參皂苷Rg3低劑量組（LRg3）、人參皂苷Rg3 中劑量組（M-Rg3）、人參皂苷Rg3 高劑量組（H-Rg3）、陽性對照藥康柏西普組（conbercept group，CB），另將未做任何處理的大鼠設為對照組（control group，CG），每組6 只。L-Rg3、M-Rg3、H-Rg3 組分別予3.65、7.20、14.40 mg/kg 的低、中、高人參皂苷Rg3 藥液灌胃，每次灌胃量為2 mL，每日1 次；CB 組予玻璃體腔注射康柏西普注射液5 μL，共計1 次；CG、MG 組大鼠灌胃2 mL 蒸餾水，每日1 次。各組均干預7 d 后進行實驗眼的觀察。

CB組大鼠玻璃體腔注射方法：聚維酮碘液于大鼠結膜囊內點眼，0.9%氯化鈉注射液沖洗，使用胰島素針距角鞏膜緣后約2 mm 處垂直穿刺鞏膜進入，隨后拔出換10 μL 微量進樣器，與眼軸成45°方向朝視盤方向刺入玻璃體腔約2 mm，緩慢推注5 μL康柏西普注射液，留針片刻撥出，涂抹氧氟沙星眼膏預防感染。

1.5 FFA觀察眼底情況

大鼠麻醉后，實驗眼使用復方托品酰胺滴眼液充分散瞳，進行紅外眼底成像，將10%熒光素鈉注射液以120 mg/kg的劑量腹腔注射，觀察熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）晚期（＞5 min）CNV 熒光素滲漏情況。取FFA 晚期像計算CNV 生成率（CNV 生成率=熒光滲漏激光斑數/激光斑總數×100%），用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計算滲漏激光斑的熒光素滲漏平均光密度（mean density，MD）值，評價CNV的發展和滲漏程度。

1.6 RT-qPCR 法檢測HIF-1α、VEGF mRNA 表達水平

麻醉處死大鼠后，分離獲取大鼠脈絡膜組織，裂解組織提取總RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，進行實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）。反應體系：2×SYRB Green Mix 10 μL+上游引物1 μL+下游引物1 μL，cDNA 1 μL，超純水補齊至20 μL；反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 °C 延伸30 s，循環39 次。采用2-△△Ct的方法進行計算各目的基因蛋白的相對表達強度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參蛋白進行對照。引物設計與構建由北京睿博興科生物技術有限公司完成（表1）。

表1 RT-qPCR實驗相關引物信息

1.7 Western Blot法檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達

處死大鼠后，分離獲取大鼠脈絡膜組織，提取總蛋白，按照蛋白定量試劑盒操作測定總蛋白濃度，進行蛋白定量，依次經凝膠、電泳、轉膜、封閉后，分別將兔抗HIF-1α抗體（稀釋比例1∶1,000）、兔抗VEGF抗體（稀釋比例1∶1,000）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（稀釋比例1∶1,000）在4 ℃搖床上孵育過夜。次日洗膜后，按照羊抗兔二抗（稀釋比例1∶4,000）室溫孵育1 h。顯影后使用Image-Pro Plus 6.0 軟件對圖像進行灰度分析，測定條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/同一樣本內參蛋白表達量。

1.8 統計學方法

使用SPSS 25.0統計分析，符合正態分布和方差齊性的計量資料，以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg3對CNV大鼠眼底情況的影響

CG組大鼠視網膜血管熒光素鈉充盈良好，視網膜血管以視盤為中心呈放射狀分布，脈絡膜血管呈網狀分布，未見熒光滲漏。其余各組光凝后早期可見光斑區呈網狀強熒光，晚期可見圓盤狀熒光輕度滲漏，邊界不清（圖1）。

MG 組大鼠CNV 生成率達66.70%，L-Rg3、MRg3、H-Rg3 組依次為63.30%、60.00%、56.70%，CB組為56.70%，差異無統計學意義（P＞0.05）。6 組間大鼠熒光素滲漏MD值比較，差異有統計學意義（F=83.940，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組MD 值升高（t=17.846，P=0.000）；與MG 組比較，MRg3、H-Rg3、CB 組MD 值降低（tM-Rg3=5.032，tH-Rg3=6.593，tCB=9.618，均P=0.000）；與H-Rg3 組比較，CB組MD 值升高（t=3.025，P=0.011），差異均有統計學意義（表2）。

2.2 人參皂苷Rg3 對CNV 大鼠脈絡膜HIF-1α、VEGF mRNA表達的影響

6 組大鼠脈絡膜HIF-1α mRNA 表達比較，差異有統計學意義（F=80.480，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組HIF-1α mRNA 表達升高（t=16.280，P=0.000）；與MG組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB組HIF-1α mRNA 表達降低（tM-Rg3=8.692，tH-Rg3=12.070，tCB=14.510，均P=0.000）；與CB 組比較，HRg3 組HIF-1α mRNA 表達升高（t=2.431，P=0.031），差異均有統計學意義（表2）。

表2 各組大鼠脈絡膜HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達（±s，n=3）

表2 各組大鼠脈絡膜HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達（±s，n=3）

注：* 與CG 組比較，P＜0.05；# 與MG 組比較，P＜0.05；△ 與H-Rg3 組比較，P＜0.05；CG 對照組；MG 模型組；L-Rg3 人參皂苷Rg3 低劑量組；M-Rg3 人參皂苷Rg3 中劑量組；H-Rg3 人參皂苷Rg3 高劑量組；CB 康柏西普組；CNV 脈絡膜新生血管；HIF-1α 缺氧誘導因子-1α；VEGF血管內皮生長因子

組別CG MG L-Rg3 M-Rg3 H-Rg3 CB F值P值mRNA 蛋白VEGF 0.12±0.03 0.92±0.03*0.94±0.04 0.68±0.06#0.52±0.03#0.36±0.10＃△104.220 0.000 HIF-1α 1.00±0.00 2.79±0.24*2.38±0.11 1.83±0.12#1.46±0.05#1.19±0.15#△80.480 0.000 VEGF 1.00±0.00 3.65±0.27*3.22±0.30 2.42±0.30#1.81±0.21#1.21±0.06#△69.000 0.000 HIF-1α 0.07±0.06 0.91±0.08*0.87±0.10 0.59±0.03#0.39±0.04#0.39±0.09＃△61.290 0.000

6組大鼠脈絡膜VEGF mRNA 表達比較，差異有統計學意義（F=69.000，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組VEGF mRNA 表達升高（t=14.500，P=0.000）；與MG 組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB 組VEGF mRNA 表達降低（tM-Rg3=6.730，tH-Rg3=10.068，tCB=13.351，均P=0.000）；與CB 組比較，H-Rg3 組HIF-1α mRNA 表達升高（t=3.283，P=0.007），差異均有統計學意義（表2）。

2.3 人參皂苷Rg3 對CNV 大鼠脈絡膜HIF-1α、VEGF蛋白表達的影響

6 組大鼠脈絡膜HIF-1α 蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=60.486，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組HIF-1α 蛋白表達升高（t=14.406，P=0.000）；與MG 組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB 組HIF-1α 蛋白表達降低（tM-Rg3=5.488，tH-Rg3=8.918，tCB=8.918，均P=0.000）；與CB 組比較，H-Rg3 組HIF-1α蛋白表達比較（P＞0.05），差異無統計學意義（表2、圖2）。

圖2 各組大鼠脈絡膜HIF-1α、VEGF蛋白的表達

6組大鼠脈絡膜VEGF蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=104.220，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組VEGF 蛋白表達升高（t=17.938，P=0.000）；與MG 組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB 組VEGF蛋白表達降低（tM-Rg3=5.382，tH-Rg3=8.969，tCB=12.557，均P=0.000）；與CB 組比較，H-Rg3 組VEGF 蛋白表達升高（t=3.588，P=0.004），差異均有統計學意義（表2、圖2）。

3 討論

AMD 是工業化國家65 歲以上人群視力喪失的主要原因之一，是一種涉及遺傳、環境、年齡等多種危險因素相互作用的復雜慢性疾病[5]。臨床上AMD主要分為干性（或稱萎縮性、非新生血管性）和濕性（或稱滲出性、新生血管性）兩型，干性AMD 主要以視力緩慢下降、后極部出現玻璃膜疣、黃斑區色素上皮增生、甚至出現地圖樣萎縮為主要表現；濕性AMD 則以視力減退較為迅速、黃斑區CNV 生長、病灶區出血、后期機化形成灰白樣瘢痕病灶為典型表現，是造成90%以上AMD 患者視力喪失的原因[6]。亢澤峰[7-8]在中醫理論指導下，結合多年臨床經驗，將濕性AMD歸屬于“瞳神絡病”范疇，提出其基礎病因為“目絡不通”，核心病機為“絡虛不榮”，以“調氣血、護氣陰、通目絡”治則指導臨床，研究[9]證實取得良好的效果。CNV 的病變在絡，與經絡臟腑的虛衰密切相關[10]，腎精虧虛，氣血不足，本虛標實，因氣累血，因虛致瘀，由虛致虛實夾雜。治療上“急則治其標”以開滯導郁瀉余為主，“緩則治其本”則以益氣養血為要，絡虛通補，或加以活血理氣，或辛味通絡。總之，益氣扶正治法應貫穿治療濕性AMD的全過程。

玻璃體腔反復注射VEGF 抑制劑是目前治療新生血管性AMD 的主要方法，其通過直接結合VEGF受體或游離的VEGF 分子發揮作用，從而降低血管通透性和新生血管增殖[11-12]。但注射頻率高、部分患者對藥物應答較慢甚至不應答、產生藥物耐受等問題，導致抗VEGF治療仍面臨多重挑戰[13-14]。中醫藥治療AMD 具有悠久的歷史，在改善患者視功能、降低患者復發率及改善患者的全身癥狀方面具有一定的優勢。人參屬五加科草本植物，藥性甘、微苦，歸肺、脾、心經，具有大補元氣、補脾益肺、生津、安神益智的功效[15]。人參含有皂苷、多糖、氨基酸、脂肪酸等多種化學成分，其中皂苷是人參各種藥理作用和生物活性的主要活性成分，目前已確定結構的人參單體皂苷達50 余種[16]。人參皂苷Rg3 屬四環三萜皂苷，分子式為C42H72O13，是人參抗腫瘤的活性成分，以其為單一活性成分的參一膠囊是我國批準上市的第一個抗腫瘤新生血管抑制劑。現代研究[17]證實，人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化與凋亡、抑制腫瘤血管生成以及增強機體免疫力等作用，對肺癌、大腸癌、前列腺癌等均有一定抑制作用。近年來，還有研究[18-19]證實，人參皂苷Rg3 應用于抗眼部新生血管方面能夠抑制CNV的生成。

目前在CNV 發病機制及其防治策略研究中，VEGF 是研究最多的促血管生成因子，而缺氧是誘導VEGF 過度表達的重要因素。低氧環境誘導HIF-1α 等因子表達，過度表達的HIF-1α 進入細胞核，HIF-1β與HIF-1α相結合形成HIF-1轉錄因子，結合VEGF 基因的3′端和5′端，誘導VEGF 的表達，促進血管內皮細胞的增殖、遷移，從而促使新生血管形成。本研究鑒于缺氧等因素在CNV 形成過程中重要作用，初步探索人參皂苷Rg3 對激光誘導的大鼠CNV 進展的干預作用，并探討其作用機制。通過532 nm激光誘導建立大鼠CNV模型，給予中藥單體人參皂苷Rg3不同劑量灌胃治療7 d，并設康柏西普玻璃體腔注藥組為陽性對照，觀察其對大鼠CNV模型的影響。通過FFA 結果顯示M-Rg3、H-Rg3 組光斑熒光滲漏強度均低于MG、L-Rg3 組，說明人參皂苷Rg3 具有抑制實驗性CNV 形成的作用。通過檢測各組視網膜脈絡膜復合組織中HIF-1α 和VEGF的相對表達量，結果顯示L-Rg3組與MD 組差異無統計學意義，M-Rg3、H-Rg3 組較MG 組顯著減少，但高于CB 組，說明人參皂苷Rg3 抑制大鼠CNV的形成，需要達到一定的灌胃劑量，即7.20 mg/kg，且在短期內CB 組優于人參皂苷Rg3 組。臨床上玻璃體腔注射康柏西普具有作用時間短、需要反復給藥、價格昂貴等局限性，因此積極探索人參皂苷Rg3有可能作為有效抑制CNV 的潛在藥物，與抗VEGF治療聯合應用，或者單獨用藥，對CNV 的治療具有重要的意義。

綜上所述，本研究發現在CNV 生成早期，人參皂苷Rg3 能夠抑制大鼠實驗性CNV 熒光素滲漏，從而延緩CNV 的發生發展，其作用機制可能與下調HIF-1α、VEGF 蛋白表達，抑制HIF-1α 信號通路的激活有關，但其臨床有效性和安全性有待進一步研究。