綠木霉T5 揮發性有機物對8 種作物種子和幼苗生長的影響

黃 竹，姚艷平

（山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

木霉屬真菌（Trichodermaspp.）分布廣泛，生長快速，環境適應能力強[1]。在植物—微生物—土壤的生物環境中，木霉具有多面的聯合作用效應，不僅具有防治多種植物病害的能力，還可促進植物生長，延緩土壤肥力下降和病原菌抗藥性的產生[2]。木霉屬真菌能夠促進種子萌發、增加植株高度、減少倒伏、增大葉片面積、促進提前開花[3-4]，與植物根系互作能夠降低植物地上、地下部分感病的概率，與根際微生物互作會影響植株的次生產物代謝[4]。以木霉菌為主要成分的多種生物肥料和生防制劑已在農業生產中被廣泛應用[5]。

木霉菌的促生作用由多種因素介導，尤其是木霉菌產生的揮發性有機化合物（VOCs）能夠促進多種植物生長并賦予植株一定的抗逆性即誘導系統抗性。大量研究已證實了木霉菌對禾谷類作物如小麥[6]、水稻[7]，蔬菜類作物如黃瓜[8]、番茄[9]，經濟類作物如煙草[10]、花生[11]的促生活性。如木霉VOCs可激活擬南芥的抗逆性并使植株增加鮮質量、根長和葉綠素含量[12]。木霉菌的VOCs 可促進禾本科作物小麥的幼苗生長[13]；使番茄植株更高更大，側根更多，增加總生物量和葉綠素含量[14]；還促進萵苣的生長并增加其葉綠素和類胡蘿卜素含量[15]；此外，還能夠增加橄欖樹中芳香揮發性有機化合物的產生[16]；提高葡萄樹愈傷組織的積累，并增強葡萄霜霉病菌接種后防御相關基因的調節[17]。

不同種類木霉菌或同種木霉菌不同菌株產生的次生VOCs 種類繁多且彼此間差異較大，包括烴、醇、內酯、呋喃、酮、醛、烷烴、烯烴、酯、芳香化合物、雜環化合物和各種萜烯[18-19]等。如在木霉—植物互作中起著關鍵作用的6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6PP），具有抑制植物病原真菌生長、促進植物生長、并誘導側根發育和改變根系結構的功能，可通過激活擬南芥對灰葡萄孢和鏈格孢的防御反應來增強植株抗性[20]。木霉菌產生的1-辛烯-3-醇可激活JA/ET 介導的激素信號轉導途徑并增強植物對病原體的抗性[21]。trichodiene 則能夠上調植株中抗性基因的表達如水楊酸通路相關基因來誘導植株獲得抗性[22]。

前期試驗表明，綠木霉T5 對玉米種子及幼苗的生長具有促進作用[23]，為了明確綠木霉T5 菌株的促生效果，探究其促生作用的廣譜性和穩定性，本研究選取谷子、藜麥、小麥等3 種農作物和白菜、番茄、辣椒、西葫蘆、南瓜等5 種蔬菜作物的種子和幼苗作為試驗材料，探索綠木霉T5 菌株產生的VOCs 對上述種子發芽和幼苗生長的影響，旨在為綠木霉T5 菌株的促生機制和活性代謝產物研究奠定基礎，為木霉菌復合種衣劑的研制與開發提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試種子：谷子（Setaria italica）（晉谷21）購自山西太谷縣藝農種子有限公司；小麥（Triticum aestivumL.）（濟麥22）購自山東魯研農業良種有限公司；藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）（綠寶藜麥）購自山東豐沛農業；辣椒（Capsicum annuum）（新一代毛粉802）購自大田種業公司；番茄（Solanum lycopersicumL.）（中研998）購自北京中研益農種苗公司；西葫蘆（Cucurbita pepoL.）（新豐抗70）購自山西王牌新特種苗有限公司；南瓜（Cucurbita moschata）（日本南瓜）購自山西太谷縣中裕種業；白菜（Brassica campestris）（夏優1 號）購自濟南時珍種業有限公司。

供試木霉菌株：綠木霉T5（Trichoderma viride）由山西農業大學植物病理實驗室提供并保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制 基礎PDA 培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L。121 ℃高壓滅菌20 min 后倒平板。

1.2.2 種子的預處理 南瓜、西葫蘆種子采用25 ℃恒溫水浴6 h，后用70%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗[24]。白菜種子采用1%次氯酸鈉消毒8 min，無菌水沖洗后浸泡30 min，28 ℃水浴鍋10 min[25]。辣椒種子采用CuSO4溶液消毒60 min，無菌水沖洗[26]。番茄種子采用70%乙醇清洗1 min，20%次氯酸鈉潤洗10 min，無菌水沖洗[27]。小麥種子采用10% 的次氯酸鈉溶液消毒15 min，用無菌水沖洗[28]。谷子、藜麥種子采用5%次氯酸鈉消毒30 min，用無菌水沖洗[29-30]。

1.2.3 綠木霉菌的培養 將綠木霉T5 接種在PDA 平板上，黑暗條件下25 ℃恒溫培養5 d。

1.2.4 綠木霉T5 揮發性有機化合物對作物的促生活性 采用改良的“皿中皿”方法[9]，將鋪濾紙的無菌培養皿浸濕，上置預處理后的種子，攤開鋪勻。每個密封大燒杯依次放入上覆微孔濾紙且長滿全皿的綠木霉平板3 皿、各放置20 粒預處理種子的平板3 皿。以放入3 皿PDA 平板及各放置20 粒預處理種子的平板3 皿為對照，每個處理重復3 次。使用封口膜覆蓋并密封燒杯杯口，記錄日期，25 ℃恒溫培養。于處理后第2 天記錄種子發芽情況，分別于第2、3、4 天測定并記錄種子萌發的根長與芽長。第4 天測定完畢后，選取10 粒萌發4 d 的幼苗放在鋪有濕潤濾紙的透氣有孔杯中，采用上下層的小型溫室方法，將綠木霉平板置于干燥器底部，其上層放置已裝有幼苗的培養杯，干燥器內用濕潤棉花保濕，干燥器蓋子涂抹凡士林密封，以放置PDA 平板和4 d 對照組幼苗的干燥器為對照，培養7 d 后統計幼苗的地上部和地下部長度、鮮質量、干質量（80 ℃烘干至恒質量）。

1.3 數據分析

采用SPSS 25.0 進行數據差異顯著性統計分析。根長、地上部和地下部長度、干鮮質量的促生率計算均參照式（1）進行。

2 結果與分析

2.1 綠木霉T5 產生的VOCs 對作物種子萌發與幼苗生長的影響

由圖1 可知，在植物—微生物揮發物共培養裝置中生長2 d 后，除白菜種子外，7 種作物種子均發芽，白菜種子在3 d 后發芽。經綠木霉T5 的VOCs處理后，除小麥、南瓜外，谷子、藜麥、白菜、番茄、辣椒、西葫蘆等作物的種子發芽率均明顯提高，與對照組發芽率差異顯著（P<0.05）。谷子種子的發芽率最高，達到96.7%，發芽促生率為13.3%，西葫蘆種子發芽率促生效果最明顯，處理后的西葫蘆種子發芽促生率達17.9%。

圖1 綠木霉T5 產生的VOCs 對8 種作物種子萌發的影響Fig.1 Effects of VOCs from T. viride T5 on seed germination of 8 crops

由圖2、3 可知，綠木霉T5 產生的VOCs 對8 種作物幼苗的根生長均具有促生活性，幼苗根長與對照組具有顯著差異（P<0.05）。綠木霉T5 的VOCs 處理2 d 后，番茄幼苗根長促生率達65.8%，顯著高于其他作物幼苗根長促生率（P<0.05）；VOCs 處理3、4 d 后，白菜幼苗根長促生率分別為56.9%、71.6%，均顯著高于其他作物幼苗根長促生率（P<0.05）。南瓜和辣椒幼苗VOCs 處理4 d 后的根長促生率也較高，分別為61.2%、60.1%?？傮w來說，綠木霉T5 的VOCs 對白菜幼苗根長的促生效果最好，對小麥幼苗根長的促生效果較差，對蔬菜類作物幼苗根生長的促生效果優于禾谷類幼苗；VOCs 處理3 d 后禾谷類作物幼苗根長促生率普遍下降，處理4 d 后回升，對蔬菜類作物根生長的促生作用沒有明顯的規律性。

圖2 綠木霉T5 產生的VOCs 對8 種作物幼苗根生長的影響Fig.2 Effects of VOCs from T. viride T5 on seedling root growth of 8 crops

由圖3、4 可知，綠木霉T5 的VOCs 處理3 d 后，谷子、小麥的芽開始生長；處理4 d 后番茄、辣椒的芽開始生長，其余種子在4 d 內芽均未生長。綠木霉T5 的VOCs 處理后，4 種作物的芽長均顯著高于對照組（P<0.05），其中辣椒幼苗的芽長促生率最高，為53.7%，小麥幼苗的芽長促生率為45.0%。

圖3 綠木霉T5 產生的VOCs 對8 種作物種子萌發和生長的影響（4 d）Fig.3 Effects of VOCs from T. viride T5 on seed germination and growth of 8 crops（4 d）

圖4 綠木霉T5 產生的VOCs 對8 種作物幼苗芽生長的影響Fig.4 Effects of VOCs from T.viride T5 on seedling bud growth of 8 crops

2.2 綠木霉T5 產生的VOCs 對幼苗生長的影響

從圖5 可以看出，綠木霉T5 產生的VOCs 處理12 d 后，作物地上部、地下部的生長與對照組相比均有顯著差異（P<0.05）。VOCs 對藜麥和白菜幼苗地上部的促生效果優于地下部分，藜麥幼苗地上部的促生率達54.3%，與其他作物的促生率差異顯著（P<0.05）；白菜幼苗地上部的促生率為45.7%。VOCs 對谷子、小麥、辣椒、南瓜幼苗地下部的促生效果優于地上部，其中，南瓜幼苗根長為120.2 mm，促生率達到69.4%，與其他作物的差異顯著（P<0.05）；VOCs 對西葫蘆幼苗地上部、地下部生長的促生效果最差，促生率分別僅為17.9%、17.5%?？傮w來說，綠木霉T5 的VOCs 對藜麥幼苗地上部的促生率較高，為54.3%；對南瓜幼苗地下部的促生效果最好，促生率達69.4%。

圖5 綠木霉T5 的VOCs 對8 種作物幼苗生長的影響Fig.5 Effects of VOCs from T. viride T5 on seedlings growth of 8 crops

2.3 綠木霉T5 產生的VOCs 對幼苗干、鮮質量的影響

由圖6 可知，綠木霉T5 產生的VOCs 處理12 d后，作物幼苗干、鮮質量均顯著高于對照組（P<0.05）。VOCs 對白菜、谷子幼苗鮮質量的促生效果較好，其中白菜幼苗鮮質量的促生率最高，為42.2%，顯著高于其他作物幼苗（P<0.05）；南瓜幼苗鮮質量的促生率較低，僅為18.8%。VOCs 對藜麥、小麥、番茄、西葫蘆、南瓜幼苗干質量的促生效果較好，其中，西葫蘆幼苗干質量的促生率最高，達81.8%，南瓜次之，促生率為75.2%，顯著高于其他作物幼苗（P<0.05）?？傮w來說，綠木霉T5 的VOCs 對8 種作物幼苗干質量的促生效果優于鮮質量的促生效果，其中，西葫蘆幼苗的干質量促生效果最好。

圖6 綠木霉T5 的VOCs 對8 種作物幼苗干質量、鮮質量的影響Fig.6 Effects of VOCs from T.viride T5 on dry weight and fresh weight of 8 crop seedlings

3 結論與討論

本研究表明，綠木霉T5 產生的VOCs 對谷子、藜麥、小麥、白菜、番茄、辣椒、西葫蘆、南瓜8 種作物種子的發芽率、芽長、根長、幼苗生長和干質量、鮮質量均有一定的促生作用。VOCs 處理后，谷子、藜麥、白菜、番茄、辣椒、西葫蘆種子發芽率均顯著提高。VOCs 對白菜的根長促生效果最好，促生率達71.6%，對辣椒種子芽長促生率達53.7%，對藜麥幼苗地上部促生率達54.2%，對南瓜幼苗地下部促生率達69.4%，白菜幼苗鮮質量增長42.2%，西葫蘆幼苗干質量增長81.8%。因此，綠木霉T5是具有較強廣譜促生效果的潛在生防木霉菌株。

從木霉菌中檢測、鑒定出的揮發性有機化合物有480 余種，如3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二醇、2-戊基呋喃等已發現在根或葉上具有促生能力[19]。6PP能夠促進植株生長和誘導側根發育[14]。FINCHEIRA等[31]從26 種木霉產生的揮發性化合物中發現，1-癸烯能夠增加擬南芥新梢的質量（38.9%）和葉綠素含量（67.8%）。綠木霉T5 產生的VOCs 中可能包含多種具有促生活性的有機化合物，多種化合物與植株間通過相互協調作用從而促進多種作物植株的生長。

綠木霉T5 的VOCs 分別處理8 種作物種子后，在不同處理時間2、3、4、12 d（出芽期和幼苗期）處理后促生效果不穩定。一方面可能是由于在植株種子萌發初期生長變化快，不同的生長階段（芽生長和根生長）起促生作用的VOCs 種類不同，因此，促生效果表現不一；另一方面可能是由于綠木霉T5 產生VOCs 的次生代謝調節是嚴密且精細的過程，不同處理時間綠木霉T5 所處的代謝調節階段不同，其產生的VOCs 的種類與數量不同，VOCs 之間、VOCs 與作物植株間的互作也會影響促生效果的體現。如LEE 等[32]研究發現，木霉菌（T.atroviride）對擬南芥5、14 d 的促生效果不同，通過GC-MS 分析發現，其VOCs 種類、數量、含量均不完全相同。有些木霉菌株能夠產生6PP，但菌株卻沒有促生能力，6PP 僅以特定劑量促進植物生長和調節根結構，并削弱病害癥狀[17]；低濃度的1-己醇可促進擬南芥生長，高濃度時抑制生長[33]。這些相關研究均表明了木霉菌促生機制的復雜性。

本試驗僅對綠木霉T5 實驗室條件下的促生活性的廣譜性和穩定性進行研究，為了使其VOCs 的促生效果達到最佳，還需開展綠木霉T5 促生活性培養條件的優化研究；同時進一步分析綠木霉T5產生的VOCs 中的促生活性成分，尋找高效促生化合物，旨在為綠木霉T5 促生機制的研究提供理論依據。