基于基因片段和形態(tài)特征分析的山西鬼筆屬物種多樣性分析

張澤乾 ，毛 寧 ，劉 虹

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

鬼筆屬Phallus是一類形態(tài)特征獨特、子實體質(zhì)地海綿狀、氣味濃郁的大型真菌，分類上隸屬于傘菌綱（Agaricomycetes）鬼筆亞綱（Phallomycetidas）鬼筆目（Phallales）鬼筆科（Phallaceae）。早期基于形態(tài)特征的分類學(xué)將鬼筆類真菌分為鬼筆屬（Phallus）和竹蓀屬（Dictyophora），區(qū)別在于竹蓀屬孢托組織下沿有一個網(wǎng)格狀裙子。現(xiàn)在的DNA分子研究顯示，這2 個類群屬于一個系統(tǒng)演化譜系，因此，Dictyophora被認(rèn)為是Phallus的異名，其中的物種全部轉(zhuǎn)移到鬼筆屬。鬼筆屬包括著名的商業(yè)食用菌品種竹蓀Dictyophoraindusiata(Vent.Pers.)Fisch.，因此受到了廣泛關(guān)注[1-4]。在分子系統(tǒng)研究出現(xiàn)之前，鬼筆屬另外一個常見物種是白鬼筆，廣布于世界各地，中國各地的白鬼筆幾乎全部被鑒定為歐洲的P.impudicusL.，并以此名稱出現(xiàn)在中國早期的所有菌類文獻中[1-4]。然而，最近一項分子數(shù)據(jù)分析研究顯示，中國分布的白鬼筆與歐洲的白鬼筆不是同一個物種，而是一個東亞地區(qū)特有的本土物種，并將其命名為冬蓀Phallus dongsunT.H.Li et al.[5]，以區(qū)別于歐洲本土物種白鬼筆。白鬼筆是一種子實體中大型的珍稀食用真菌，在我國南部常見且已有人工培育產(chǎn)品，商品名稱為白冬蓀，是一種受歡迎的食用菌品種，其營養(yǎng)價值和風(fēng)味口感與著名的竹蓀相同。

鬼筆類真菌多數(shù)可以藥用和食用，在世界范圍內(nèi)各大洲均廣泛分布，我國鬼筆類真菌資源豐富，目前已報道有27 個種，主要分布在西南和華南地區(qū)[2-3]，北方地區(qū)分布較少。自2017 年開始，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院野生菌團隊連續(xù)在山西各地采集調(diào)查大型食用真菌物種多樣性，在多地采到多份鬼筆類真菌樣本，其中一個重要的發(fā)現(xiàn)是在山西南部中條山脈中部和東部區(qū)域發(fā)現(xiàn)2 種大型鬼筆，一種為白色，一種為黃色。白色鬼筆屬于中國常見的白鬼筆（冬蓀鬼筆），黃色樣本顏色類似于黃脈鬼筆Phallus flavocostatusKreisel 和細鬼筆Phallus tenuis（E.Fisch.）Kuntz.[5-6]，但這2 種黃色的鬼筆子實體均為小型，除去顏色外，其他特征都明顯不同。

為明確這種黃色鬼筆以及山西其他鬼筆類樣本的準(zhǔn)確分類學(xué)定位，本研究通過采用ITS 和LSU這2 個位點的基因片段進行建樹分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，共鑒定出鬼筆屬3 個物種，其中黃色樣本被鑒定為冬蓀鬼筆的黃色品種，這是黃色冬蓀鬼筆在世界上首次發(fā)現(xiàn)，它的存在和發(fā)現(xiàn)為冬蓀品種的人工馴化培育和育種提供了新的材料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究標(biāo)本共8 份，其中黃色冬蓀樣本4 份，采集于我國北方山西省中條山脈和呂梁山脈中段關(guān)帝山。其中，中條山脈位于山西省南部，屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，年平均溫度12～14 °C，年降水量600～800 mm，最高點海拔為2 358 m，植被以油松（Pinus tabuliformisCarr.）、華山松（Pinus armandiiFranch.）、多種櫟樹（Quercusspp.）等為建群種的暖溫帶森林為主，局部有亞熱帶小環(huán)境區(qū)域，土壤類型自下而上依次為沖積土、山坡褐土、山地淋溶褐土和山地草甸土。呂梁山脈位于山西省西部大體呈南北走向，中段的關(guān)帝山屬大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫3.5 °C，年降水量830 mm，最高點海拔為2 831 m，土壤類型主要有山地棕壤、山地褐土、亞高山草甸土和洪泛平原草甸土，植被主要有華北落葉松（Larix principis-rupprechtiiMayr.）、云杉（Piceaspp.）、松樹（Pinusspp.）、楊樹（Populusspp.）、樺樹（Betulaspp.）純林或混交林等。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)特征鑒定 在野外采集標(biāo)本并拍照記錄，然后在40～50 °C 的干燥機中干燥。干燥后的標(biāo)本保存在首都師范大學(xué)植物標(biāo)本室（BJTC）和山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院植物標(biāo)本室（HSA）。從新鮮標(biāo)本中記錄宏觀特征，標(biāo)準(zhǔn)顏色值依據(jù)ColorHexa（http://www.colorhexa.com/）；將干燥樣本手工切薄片放在含有3%氫氧化鉀、剛果紅、梅爾澤試劑[7]或乳酸棉藍的載玻片上，加蓋玻片在顯微鏡下觀察微觀特征。擔(dān)孢子的尺寸使用“（a-）b-c（-d）”形式的符號表示。“b-c”范圍至少包含90%的測量值。括號中給出了極值“a”和“d”。Q 為側(cè)視圖中擔(dān)孢子的長寬比；Qav 是指所有擔(dān)孢子的平均值Q，包括樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.2 DNA 提取、PCR 擴增和DNA 測序 本研究獲得了ITS 和LSU 區(qū)域的序列。使用NuClean Plant Genomic DNA Kit（中國CWBIO）從山西省新采集的樣本中提取基因組DNA。使用引物ITS1-F/ITS4 擴增ITS 區(qū)域（White et al.1990；Gardes &Bruns 1993）[8-9]，使用引物L(fēng)R0R/LR5（Vilgalys &Hester 1990）[10]擴增28S 大亞基nrDNA（LSU）區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系25 μL：2 μL DNA 模板，上、下引物各1 μL（10 μmol/L），12.5 μL 2×Master Mix，8.5 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：94 °C 變性5 min；94 °C 30 s，55 °C 45 s（ITS）/60 s（LSU），35 次循環(huán)；72 °C 1 min；72 ℃下延長10 min。將PCR 產(chǎn)物送至北京中科西林生物技術(shù)有限公司進行純化、測序和編輯。驗證合格的DNA 序列保存在GenBank數(shù)據(jù)庫中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），登錄號如表1 所示。

表1 本研究引證的樣本及其GenBank 登錄號Tab.1 Specimens and their GenBank accession numbers in this study

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 基于ITS-nrLSU 數(shù)據(jù)集進行系統(tǒng)發(fā)育分析。ITS 和LSU 序列數(shù)據(jù)包含：本研究從新標(biāo)本提取測定的序列，一些重要文章先前使用的序列[5]，通過Blast 工具從GenBank 檢索下載的一些相關(guān)序列。編輯ITS 和LSU 序列用于鑒定和研究山西省黃色鬼筆類物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在默認(rèn)參數(shù)下，每個序列分別在MAFFT v.7.110 中對齊[11]，使用默認(rèn)參數(shù)的Gblocks v.0.91b 識別對齊不佳的位點[12]，然后將對齊的ITS 和LSU 序列連接起來以進行進一步的系統(tǒng)發(fā)育分析。在進行系統(tǒng)發(fā)育分析之前，排除了所有確定的模糊位點，任氏蛇頭菌Mutinus zenkeri被選作外類群。

使用參數(shù)未鏈接的GTRGAMMAI 替代模型（針對所有分區(qū)），使用RAxML 8.0.14[13-15]進行最大似然（ML）分析。使用快速引導(dǎo)分析搜索最簡約的ML樹，在RAxML 中計算ML 引導(dǎo)重復(fù)次數(shù)（1 000），ML 樹用TreeView 32 生成[16]。自舉值（BS）≥70%的進化分支被認(rèn)為得到了大力支持[17]；貝葉斯法（BI）使用MrBayes v3.1.2[18]作為評估分支支持的附加方法。在BI 分析中，在選擇由MrModeltest v2.3[19]確定的最佳替代模型GTR+I+G（用于ITS和nrLSU）后，使用默認(rèn)設(shè)置，對10000000 代馬爾可夫鏈蒙特卡羅（MCMC）進行了2 次四鏈獨立運行，每100 代采樣一次。溫度值降至0.20，老化設(shè)置為0.25，一旦分離頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差達到0.01 以下，運行就會自動停止。構(gòu)建70%多數(shù)規(guī)則共識樹，用TreeView 32 生成進化樹[16]，貝葉斯值（BPP）≥95%被認(rèn)為得到了顯著支持[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子系統(tǒng)發(fā)育

本研究中，新標(biāo)本自測產(chǎn)生11 條ITS 和LSU序列。ITS-nrLSU 組合數(shù)據(jù)集矩陣包括來自12個分類單元的56條序列（ITS 29條，nrLSU 27條），包含1 445 個堿基（ITS 562 個，LSU 883 個）。本研究引用的相關(guān)分類群中，從山西省采集的所有黃色鬼筆標(biāo)本都與包含有模式序列的白色冬蓀鬼筆聚為同一個末端分支，并得到了強有力的支持（BS=99%，BPP=1.00）（圖1），Blast 顯示，該末端分支中每個標(biāo)本的ITS 和LSU 序列的相似性都超過98.8%。結(jié)果表明，山西省采集的所有黃色鬼筆在系統(tǒng)發(fā)育上與白色的冬蓀鬼筆屬于同一個物種。

圖1 基于ITS-nrLSU 序列的鬼筆屬Phallus 系統(tǒng)發(fā)育樹（ML）Fig.1 Phylogenetic tree of Phallus based on ITS-nrLSU sequences（ML）

2.2 形態(tài)分類結(jié)果

2.2.1 冬蓀鬼筆Phallus dongsunT.H.Li，T.Li，Chun Y.Deng，W.Q.Deng &Zhu L.Yang，in Li，Li，Deng，Song，Deng &Yang，Phytotaxa443（1）：29（2020）

2.2.1.1 黃色品種形態(tài)特征 菌蛋近球形到卵圓形，50～70 mm×45～65 mm，灰白色頭淺灰色，表面光滑，基部有白色菌索與土壤相聯(lián)。外包被膜質(zhì)，內(nèi)包被膠質(zhì)，無色。成熟子實體高145～250 mm，直徑30～50 mm。孢托鐘形到近圓錐形，淡黃色、黃色到橙黃色，長45～65 mm，直徑30～48 mm，表面不規(guī)則深網(wǎng)格狀，網(wǎng)眼深4～7 mm，頂部鈍圓或平截，具一個3～5 mm 的橢圓或近圓形小孔，初期被綠色產(chǎn)孢組織完全覆蓋。產(chǎn)孢組織橄欖綠色，黏。假柄柱狀或棒狀，通常向頂部漸細、向基部變粗，長150～200 mm，粗40～60 mm，淡黃色或黃色，海綿質(zhì)，中空，壁厚5～8 mm，表面具直徑1～3 mm 的不規(guī)則小腔。菌托卵圓形，高40～55 mm，直徑30～40 mm，表面平滑或微皺，灰白色偶然淺灰色。菌索白色，直徑1～2 mm，長可達50 mm（圖2、3）。氣味惡臭，味道沒有記錄。

圖2 黃色冬蓀鬼筆的擔(dān)子果Fig.2 Basidiomata of yellow Phallus dongsun

圖3 山西黃色冬蓀鬼筆的顯微鏡特征Fig.3 Microscopic characteristics of yellow Phallus dongsun

擔(dān)孢子長橢圓形或稍呈圓柱狀，4.4～5.2 μm×1.9～2.5 μm，Q=1.92～2.27，Qm=2.12，無色，非淀粉質(zhì)，薄壁，光滑，內(nèi)含一個油滴。孢托組織由膨大的菌絲和間雜的球形或不規(guī)則球形的細胞組成，薄壁，無色，直徑5.0～7.5 μm。假柄擬薄壁組織型，細胞球形或近球形，直徑10～25 μm。菌托菌絲直徑3.0～7.5 μm，分隔，薄壁，具鎖狀聯(lián)合。菌索菌絲直徑3.0～11.0 μm，薄壁，分隔，含分枝，具鎖狀聯(lián)合。

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，松樹（Pinusspp.）、櫟樹（Quercussp.）或楊樹（Populussp.）純林或混交林下地上。已知分布于我國山西省。

標(biāo)本：山西省方山縣麻地會鄉(xiāng)關(guān)帝山，楊樹Populussp.林地上，2018年8月31日，曹晉忠，LH329（HSA329）；翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2018 年9 月10 日，劉虹，LH511（HSA511）；翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2019 年8 月26 日，劉虹，LH1409（BJTC FM1546）；夏縣泗交鎮(zhèn)櫟樹Quercussp.林地上，2020 年10 月6 日，毛寧，MN083（FANM1607 BJTC）。

2.2.1.2 白色品種特征 菌蛋近球形到卵圓形，45～75 mm×42～68 mm，污白色、白色、灰白色頭淺灰色，表面光滑，基部有白色菌索與土壤相聯(lián)。外包被膜質(zhì)，內(nèi)包被膠質(zhì)，無色。成熟子實體高140～260 mm，直徑35～50 mm。孢托鐘形到近圓錐形，白色，長43～67 mm，直徑32～46 mm，表面不規(guī)則深網(wǎng)格狀，網(wǎng)眼深4～6 mm，頂部鈍圓或平截，具一個3～5 mm 的橢圓或近圓形小孔，初期被綠色產(chǎn)孢組織完全覆蓋。產(chǎn)孢組織橄欖綠色，黏。假柄柱狀或棒狀，通常向頂部漸細、向基部變粗，長150～220 mm，粗41～63 mm，白色，海綿質(zhì)，中空，壁厚5～8 mm，表面具直徑1～3 mm 的不規(guī)則小腔。菌托卵圓形，高41～55 mm，直徑32～41 mm，表面平滑或微皺，灰白色偶然淺灰色。菌索白色，直徑1～2 mm，長可達55 mm（圖4）。氣味惡臭，味道沒有記錄。

擔(dān)孢子長橢圓形或稍呈圓柱狀，4.0～5.5 μm×1.8～2.5 μm，無色，非淀粉質(zhì)，薄壁，光滑，內(nèi)含一個油滴。孢托組織由膨大的菌絲和間雜的球形或不規(guī)則球形的細胞組成，薄壁，無色，直徑5.0～7.5 μm。假柄擬薄壁組織型，細胞球形或近球形，直徑10～25 μm。菌托菌絲直徑3.0～7.5 μm，分隔，薄壁，具鎖狀聯(lián)合。菌索菌絲直徑3.0～10 μm，薄壁，分隔，含分枝，具鎖狀聯(lián)合。

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，多種針葉林或闊葉林純林或混交林下地上。已知分布于我國南北各地。冬蓀鬼筆白色品種形態(tài)特征和黃色品種區(qū)別為孢托和假柄為白色。

標(biāo)本：山西省翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2018 年9 月10 日，劉虹，LH504（HSA504）；翼城縣中條山脈歷山松樹溝，松樹Pinussp.林地上，2019 年9 月10 日，劉虹，LH444（HSA444）。

2.2.2 紅鬼筆Phallus rugulosus（E.Fisch.）Lloyd，Mycol.Writ.（Cincinnati）2（Letter 31）∶402（1908）菌蛋卵圓形或蛋形，白色或灰白色，基部具白色或灰白色根狀菌索。成熟后菌蛋頂部破裂，孢托組織由假柄支撐伸出，總高100～210 mm，直徑20～30 mm。孢托鐘形或圓錐形，紅色，高15～39 mm，直徑10～20 mm，頂部有一小孔，表面被有橄欖色孢子黏液。假柄圓柱狀，海綿質(zhì)，長60～130 mm，直徑10～20 mm，上部淺紅色，向下漸成白色或灰白色，表面有蜂窩狀小孔。菌托包狀或袋狀。氣味惡臭。擔(dān)孢子橢圓形，無色，3.5～4.5 μm×1.5～2.0 μm（圖5）。

圖5 紅鬼筆的擔(dān)子果Fig.5 Basidiomata of Phallus rugulosus

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，多種林下地上。已知分布于我國南北各地。

標(biāo)本：山西省沁水縣土沃鄉(xiāng)上沃泉村，楊樹Populussp.林地上，2018年9 月10 日，劉虹，LH1188（BJTC FANM1132）。

2.2.3 超短裙鬼筆Phallus ultraduplicatusX.D.Yu，W.Lv，S.X.Lv，Xu H.Chen &Qin Wang，in Adam?ík et al.，Cryptog.Mycol.36（2）：147（2015）菌蛋近球形，白色或灰白色，65～80 mm×70～80 mm，基部具白色或灰白色根狀菌索。成熟后菌蛋頂部破裂，孢托組織由假柄支撐伸出，總高150～230 mm。孢托鐘形或圓錐形，白色或黃白色，高35～50 mm，直徑20～30 mm，頂部有一小孔，深網(wǎng)格狀，表面被有橄欖色孢子黏液。菌裙白色，長20～40 mm，海綿質(zhì)，具多角形網(wǎng)眼。假柄圓柱狀，海綿質(zhì)，長100～190 mm，直徑20～35 mm，白色或淺黃白色，表面有蜂窩狀小孔。菌托包狀或袋狀。氣味惡臭。擔(dān)孢子橢圓形，無色，4.0～5.1 μm×1.5～2.0 μm（圖6）。

圖6 超短裙鬼筆的擔(dān)子果Fig.6 Basidiomata of Phallus ultraduplicatus

習(xí)性、生境和分布：單生、散生或群生，針葉林下地上。已知分布于山西和中國北部地區(qū)。

標(biāo)本：山西省交城縣關(guān)帝山龐泉溝，云杉Piceasp.林地上，2018年8月31日，劉虹，LH314和LH315；興縣黑茶山，油松Pinus tabulifornis林地上，2018 年9 月6 日，李素玲，LH376。

3 結(jié)論與討論

冬蓀鬼筆在我國南部貴州、云南地區(qū)是一種常被當(dāng)?shù)厝瞬杉秤茫⒁驯蝗斯づ嘤氖秤媚⒐轿锓N[5]。本研究基于ITS 和LSU 聯(lián)合分析證實，山西分布的大型黃色鬼筆在分類學(xué)上屬于冬蓀鬼筆Phallus dongsun，盡管它的子實體顏色與典型的冬蓀鬼筆有所不同。同一物種具有不同顏色的現(xiàn)象在大型菌類中并不罕見，如生長在落葉松林下的厚環(huán)乳牛肝Suillus grevillei（Klotzsch）Singer 典型的子實體顏色為紅褐色，但是黃色的類型并不罕見[21]，再如白灰乳菇Lactarius albidocinereus子實體有白色和灰色2 種類型[22]，作者在山西多年采集發(fā)現(xiàn)這個物種的2 種顏色個體在山西均有發(fā)生，其中灰色子實體的品種在山西南部更為多見。

本研究共發(fā)現(xiàn)有3個鬼筆屬Phallus物種在山西的分布得到了數(shù)據(jù)支持，即冬蓀鬼筆P.dongsun（包括白色和黃色2 個類型）、紅鬼筆P.rugulosus和超短裙鬼筆（超短裙竹蓀）P.ultraduplicatus。其中，冬蓀鬼筆的白色類型僅見于山西南部的中條山脈，黃色的類型除中條山外，還在呂梁山脈中北部的關(guān)帝山楊樹林下有分布。紅鬼筆見于中條山脈東段的歷山區(qū)域，而超短裙鬼筆分布于呂梁山脈的關(guān)帝山和黑茶山的云杉Piceasp.和油松林下。本研究是首次在自然界發(fā)現(xiàn)冬蓀鬼筆有野生黃色品種存在，這對冬蓀鬼筆的人工培育和育種增加了新的選擇。食用黃冬蓀野生馴化、生物學(xué)特性及其栽培條件是否與白色冬蓀一致，還有待于進一步探索研究。