西雙版納黃瓜種質的改良

孫宇紅 謝翌帆 秦培超 普文才 何歡樂* 張慧婷

（1 上海市閔行區三農綜合服務中心，上海 201109；2 上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；3納板河流域國家級自然保護區管理局，景洪 666100） *為通信作者

黃瓜(Cucumis sativusL.)是我國重要的蔬菜作物之一，以設施栽培為主，可周年供應，經濟效益高，且果實脆嫩爽口，深受大眾喜歡。但是，黃瓜的遺傳背景相對較窄，不利于品種改良，故挖掘和利用各類種質資源，引入更多的優異基因，成為了當前黃瓜育種的趨勢之一。

黃瓜起源于喜馬拉雅山南麓，我國的西雙版納地區是黃瓜的起源地之一[1]。西雙版納黃瓜（C.sativusL.var.xishuangbannanesis）是在長期地理隔離和交流受限等條件下形成的特殊種質群體，與其他黃瓜材料的遺傳距離相對較遠，屬于半野生材料，具有長勢強、抗性強、果實外形粗大、單瓜質量為2～3 kg、老瓜果肉和胎座均呈橙黃色、果肉富含β-胡蘿卜素、果實耐貯藏等特性[2-5]。但是，隨著黃瓜商業品種在云南省的大量種植和上市，當地的西雙版納黃瓜品種受到了很大沖擊。目前，西雙版納黃瓜品種以農家零星種植為主，栽培面積逐年減少，亟需對其進行足夠的保護和利用，以發揮其資源潛力。同時，由于長期適應云南西雙版納地區的短日照條件，西雙版納黃瓜品種在長日照地區種植普遍表現為晚開花[6-8]、生長周期長、主蔓雌花率較低、白粉病抗性不夠理想等，不利于直接將其應用于育種，需要先對其進行相應的遺傳改良，再進行應用。鑒于此，筆者對西雙版納黃瓜進行了種質改良，即將西雙版納黃瓜農家種與歐洲溫室型自交系進行雜交，然后將西雙版納黃瓜農家種作為輪回親本，回交3 代，同時利用黃瓜白粉病抗性基因與全雌基因F的連鎖標記進行輔助選擇，以期獲得早花、全雌、抗白粉病的西雙版納黃瓜自交系，從而為黃瓜抗白粉病品種的選育與西雙版納黃瓜農家種的有效利用奠定基礎。現將相關改良情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種包括歐洲溫室型自交系SA0422、西雙版納黃瓜農家種BN5-1 和BN38。其中，SA0422的抗白粉病等級為抗病，具有白粉病抗性基因pm5.1和PM5.2，開花習性為早花、全雌，雌花率為100%；BN5-1 和BN38 的抗白粉病等級均為中間類型，開花習性為晚花，雌花率低，老熟瓜果肉心腔顏色為橙黃色，5心皮。另外，以白粉病抗性測定為感病的華北型自交系9930作為對照品種。黃瓜材料均種植在上海交通大學農業與生物學院的溫室中，采用懸吊式、基質滴灌栽培，統一水肥管理。

1.2 種質改良方法

1.2.1 黃瓜遺傳改良方案

將西雙版納黃瓜農家種BN5-1 和BN38 分別與歐洲溫室型自交系SA0422（供體親本）進行雜交，然后用輪回親本BN5-1 和BN38 各回交3 代，最后自交獲得純合株BN5-1R 和BN38R，回交和自交后代植株利用白粉病抗性基因（pm5.1和PM5.2）與全雌基因F的連鎖標記進行輔助選擇（Markerassisted selection，MAS）。在回交后代MAS 的前景選擇中，挑選出含供體親本條帶的植株定植于田間。早花性狀為顯性，可通過田間早花表型選擇后代植株。在改良后代自交系鑒定中，每個自交系材料分別種植10 株，重復3 次，隨機區組設計。

1.2.2 白粉病抗性鑒定

在黃瓜成株期（植株具有15～20張葉片），調查植株最下方的5～6張真葉的白粉病發生情況，并記錄發病等級（分為5個等級）[9-10]。其中，發病等級小于1.5 時，記為抗白粉病（R）；發病等級大于等于1.5、小于3.0 時，記為中間類型（M）；發病等級大于等于3.0 時，記為感白粉病（S）。

1.2.3 田間始花時間和雌花率調查

始花時間的調查：記錄每株材料主蔓上第一朵花的開放時間。

雌花率調查：記錄黃瓜植株主蔓上每個節位的開花類型，雌花率為主蔓前20節上著生雌花節位數的百分比。

1.2.4 分子標記輔助選擇

在黃瓜植株苗期，采集1/4 片子葉，采用改良CTAB 法[11]提取基因組DNA，并利用目標基因連鎖標記進行MAS，然后從回交群體中篩選出含供體親本帶型的植株定植于溫室，用于后續的田間選擇和回交等。目標基因具體為：（1）白粉病抗性基因pm5.1。選擇黃瓜抗白粉病基因pm5.1的InDel 標記InDel-MLO 1，其正向引物為5'- G C TA TT TG C TG TT C TCTTCATCCT-3'，反向引物為5'- TCATATT G T G A A C T T A C C C C A T T G-3' 。P C R 和電泳檢測參照相關文獻[9-10]。（2）白粉病抗性基因PM5.2。利用PM5.2緊密連鎖標記S-InDel-98 進行該抗性基因的MAS。標記S-InDel-98 與PM5.2 基因的物理距離小于20 kb，其正向引物為5'-TGAATATT T G T G T T A T G T G T G G G-3' ，反向引物為5'-T G A A A T T G A G A A T G G A A G G G-3' 。（3）全雌基因F。黃瓜全雌基因F（CsACS1G）的共分離標記參照Mibus 等[12]的方法，其正向引物為5'-TTAAC T AC TT C GG A CG GG C AT A G-3'，反向引物為5'-A G G T G T T C A G C A A A C A T A G G G T G-3' 。

1.3 數據處理與分析

采用Excel軟件對試驗數據進行處理和統計性分析，采用SPSS 17.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 黃瓜回交后代植株的分子標記輔助選擇

在回交轉育改良西雙版納黃瓜農家種過程中，在苗期進行MAS，即利用目標性狀（抗白粉病和全雌）的連鎖標記選擇回交后代植株，挑選出含有目標區段的小苗20～30 株，定植于溫室，再通過田間早花表型選擇后代植株，繼續回交或自交留種。

在pm5.1基因的MAS 中，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，InDel-MLO1 標記可顯著區分白粉病抗性為中間類型的親本BN5-1 和抗病親本SA0422，F1包含兩個親本的帶型，由于此抗病基因為隱性遺傳，故雜合帶型個體對應為感病植株，這與聶京濤等[9]的結果一致。最終，從回交群體中選出含pm5.1基因的雜合個體，或從F2 群體中選出含pm5.1基因的純合個體。見圖1。

圖1 抗白粉病基因pm5.1 共分離標記InDel-MLO1篩選黃瓜回交群體的電泳結果

利用PM5.2緊密連鎖標記S-InDel-98 篩選出黃瓜回交后代植株，挑出含供體親本帶型的后代植株，其白粉病抗性與預期相符。見圖2。

圖2 抗白粉病基因PM5.2 連鎖標記S-InDel-98篩選黃瓜回交群體的電泳結果

由圖3 可知，利用全雌基因F的標記進行MAS，基因型為ff的西雙版納黃瓜植株不含CsACS1G基因，沒有該標記的PCR 擴增帶，故利用全雌基因F的標記可以在苗期快速篩選出具有全雌基因F的后代植株。

圖3 全雌基因F 共分離標記篩選黃瓜回交群體的電泳結果

2.2 西雙版納黃瓜改良后代的表型分析

通過雜交和回交，將目標性狀基因導入西雙版納黃瓜農家種BN5-1 和BN38 中，經過3 次回交，然后自交1～2 代，同時結合MAS 和田間表型選擇，最后獲得目標基因純合株系BN5-1R 和BN38R。將其后代植株種植于田間，進行相應的表型鑒定，進一步確認目標性狀的改良情況。

由表1可知，對照材料9930的平均白粉病病級最高，其抗病性顯著低于其他自交系，感病程度與預期一致；西雙版納黃瓜農家種BN5-1 和BN38均為中間類型，對白粉病具有一定的抗性，病級顯著低于9930，兩材料之間的白粉病病級差異不顯著；SA0422 的平均病級為0，表現為高抗白粉病；回交轉育含白粉病抗性基因的西雙版納黃瓜自交系BN5-1R 和BN38R 的平均病級與SA0422 相近，即為抗白粉病，這3個自交系間的白粉病病級差異不顯著。由此表明，種質改良成功導入了2個白粉病抗性基因，提高了西雙版納黃瓜農家種的白粉病抗性。

表1 黃瓜田間性狀的調查情況

由表1 可知，SA0422 的始花時間約為30 d，顯著低于其他材料；而BN5-1 和BN38 的始花時間較長，約58 d，2個材料間的始花時間差異不顯著；改良后代BN5-1R 和BN38R 的始花時間大幅度降低，約32 d，接近于親本SA0422。在植株雌花率方面，SA0422 為全雌，雌花率約為100%，顯著高于其他材料；而BN5-1 和BN38 雌花率均較低，在主蔓的前20節上沒有出現雌花，與沈鏑等[13]的研究結果一致；遺傳改良后代BN5-1R 和BN38R 的雌花率大幅度提高，有些植株前面幾節無花芽，但植株產生的花芽均為雌花，即實際雌花率達100%，這與植株的F純合基因型相符。

綜上，通過雜交和回交，成功地將4個目標性狀基因導入西雙版納黃瓜中，獲得了早花、全雌型、抗白粉病的改良株系，且保持了原材料果肉橙黃色、黃瓜味濃厚的特性，這為西雙版納黃瓜資源的廣泛應用打下了基礎。

3 結論與討論

在黃瓜生產上，白粉病的發生非常普遍，應用抗病品種是防治該病害的主要策略之一。黃瓜白粉病抗性基因pm5.1為隱性抗病基因，在常規育種中回交轉育時無法根據回交當代的表型選擇后代，需要通過自交后的抗性鑒定確認抗性基因，但育種周期長、效率低、費時費力，而利用隱性基因的連鎖標記輔助育種可以突破該瓶頸。本研究對西雙版納黃瓜農家種的改良，充分體現了MAS 的優勢，在苗期即可進行大規模篩選，不需要進行抗病接種鑒定，且選種準確，節約了大量的田間栽培時間和管理投入。同時，本研究對西雙版納黃瓜農家種的白粉病抗性的遺傳改良結果，也再次驗證了pm5.1和PM5.2是黃瓜主要的白粉病抗性基因，這兩個基因均是抗白粉病表型所必需的，且本研究進一步確認了抗白粉病基因型為pm5.1 pm5.1/PM5.2，其他基因型的植株葉片均會產生白粉病斑，白粉病抗性低于供體親本（pm5.1 pm5.1/PM5.2 PM5.2）。

對于黃瓜白粉病抗性和全雌性狀的MAS，前期的研究基礎很關鍵。黃瓜全雌基因F、白粉病抗性基因pm5.1和PM5.2已經克隆，而且這幾個基因在供試的西雙版納黃瓜材料中的基因型也已經過相應的測序確認，均為pm5.1 pm 5.1/PM5.2 PM 5.2/ff。根據親本間的基因組DNA 序列差異，容易開發出更合適的標記用于MAS。這些先決條件促進了相應連鎖標記的開發和應用，保障了MAS 的成功。

已有研究顯示，黃瓜早花性狀受多個基因調控，主要與FLOWERING LOCUS T(FT)及其周邊序列差異密切相關[6-8]。由于本研究尚未確認供試親本在早花基因上的差異，沒有開發和應用相應的連鎖標記，這在一定程度上增加了回交轉育過程中的田間工作量。

在表型分析時，遺傳改良自交系B N 5-1 R 和BN38R 的始花時間和雌花節數接近供體親本，但仍存在細微差異；同時，植株前1～2節的花芽生長遲緩，這可能是受其他微效基因的影響，也有待進一步的研究。

在田間，未改良的西雙版納黃瓜植株葉片有白粉病斑發生，但病斑的擴展速度較慢，植株整體呈現耐病表型，而遺傳改良自交系BN5-1R 和BN38R均呈現很高的白粉病抗性，且同時具有歐洲溫室型黃瓜的早花、全雌性狀，這為黃瓜抗白粉病品種的選育與西雙版納黃瓜農家種的有效利用提供了極大的便利。