‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種親本組織培養提純復壯技術

邢博聞 趙晟晨 湯桂鈞 胡海峰 姜亮 趙韻 王能 殷麗青

（1 上海市閔行區農產品質量安全中心，上海 201109；2 上海三友種苗有限公司，上海 201617；3 上海市閔行區農業技術服務中心，上海 201199；4 上海市閔行區三農綜合服務中心，上海 201109；5上海市農業科學院林木果樹研究所，上海 201403） *為通信作者

七寶十條筋黃金瓜是上海市四大名瓜之一，距今已有100 多年的栽培歷史，深受廣大市民青睞，2019年被列為農產品地理標志產品。‘三友金香’是由上海三友種苗有限公司于近年通過雜交配組選育而成的七寶十條筋黃金瓜新品種（F1代組合），2017年12月注冊登記為國家農業農村部非主要農作物新品種[編號：GPD甜瓜（2017）310036][1]。2018年開始，‘三友金香’作為可替代老七寶十條筋黃金瓜的新品種，在長三角地區被廣泛推廣應用。

甜瓜為異花授粉作物，常受昆蟲、風力等外界自然因素的影響而產生天然雜交，致使品種的優良遺傳性狀發生退化與變異。為保證其種性長期不發生混雜和退化，生產單位常采用人工單株（單瓜）選擇的方法進行提純復壯，以獲得純合一致的種子。鑒于七寶十條筋黃金瓜是異花授粉作物，采用人工單株（單瓜）選擇的方法進行提純復壯，其效果甚微，更無法脫病毒。而應用組織培養技術，特別是莖尖離體培養方法，不僅可有效解決品種退化和自然雜交混雜的問題，還具有工廠化快繁、脫病毒的優勢。例如，廣泛采用莖尖脫毒方法，可在無菌條件下培養獲得脫毒植株[2]。在此背景下，為了使‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種優良種性不退化及保持雜交雙親的高度純合，筆者進行了‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種親本組織培養提純復壯技術研究，主要通過應用莖尖離體培養方法，對其雜交雙親（編號為M2014-09 虎皮斑金黃十條筋和M2014-18 橙黃斑金黃十條筋）進行提純復壯，最終育出了優質試管苗，經鑒定純度達99%以上?，F將相關研究結果報道如下，以期為‘三友金香’七寶十條筋黃金瓜新品種的推廣應用奠定基礎。

1 外植體發生培養

1.1 雜交雙親來源

在原七寶十條筋黃金瓜的原始群體中，通過多年多代自交、回交，選育獲得高純度的親本材料。其中，以M2014-09 虎皮斑金黃十條筋黃金瓜為母本，M2014-18 橙黃斑金黃十條筋黃金瓜為父本。

1.2 外植體取材

2個親本于3月上旬在上海三友種苗有限公司位于閔行區浦江鎮育種基地的塑料大棚內進行育苗；4月中旬進行移栽；5 月上旬、主蔓4 葉1 心時進行摘心，不久主蔓即抽生2～3根子蔓；待到5月中下旬、子蔓長至5 葉以上時，剪取長度約4 cm 的子蔓頂端作為外植體，存放于塑料瓶中，并擰緊瓶蓋，以防其失水萎蔫。

1.3 外植體的清洗與消毒

將剪取的子蔓頂端用洗潔精清洗3遍后，用干凈紗布包裹，然后置于水龍頭下用自來水沖洗2 h。然后，在超凈工作臺上將上述材料用3步法進行消毒：第1 步，用75%酒精消毒1 min，無菌水沖洗1 遍；第2 步，用1∶50 的潔爾敏消毒15 min，無菌水沖洗1 遍；第3 步，用12%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗3 遍，最后用無菌濾紙吸干材料備用。

1.4 莖尖的剝取與接種

因甜瓜屬雙子葉植物，與大部分單子葉植物相比，其莖尖不是特別明顯，故需在超凈工作臺上借助80 倍解剖鏡用解剖針、手術刀小心剝取莖尖，長度掌握在0.5～1.0 mm；切取莖尖以下0.5 cm 長度的頂端，接種于發生培養基上，每瓶接種1 個莖尖，以誘導莖尖生長，使其成為無菌系的“叢生芽”。

1.5 發生培養

發生培養基配方以MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L（另加瓊脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，調節pH 至5.8 左右）較為適宜，培養室溫度為24 ℃、24 h 恒溫，光照時間為12 h/d（7:00—19:00），光照強度為3 000 lx 左右（采用LED 光源），光照與溫度實行自動調節控制，最終莖尖發生成功率可達98%，且莖尖生長早而快。

2 無菌系的繼代增殖培養

2.1 繼代增殖培養基配方

繼代增殖培養基配方以MS+BA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L（另加瓊脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，調節pH 至5.8 左右）較為適宜，在25 d 增殖1 次的情況下，增殖系數可保持在1∶3.0～4.5的合理區間內，且瓶苗生長健壯，無“玻璃苗”產生。

2.2 培養周期

繼代增殖培養的培養周期以25 d左右為宜，在此培養周期內，瓶苗葉色正常，叢生芽生長較多，枝條直立挺拔。當培養周期超過25 d（尤其是超過30 d）時，瓶苗生長變差，葉色褪淡甚至發黃，部分枝條細長扭曲，達不到壯苗的標準。

2.3 培養室條件

繼代增殖培養的培養室溫度為25 ℃、24 h 恒溫，光照時間為12 h/d（7:00—19:00），光照強度為3 500 lx 左右（采用LED 光源），光照與溫度實行自動調節控制。值得注意的是，在繼代增殖培養中，需掌握好培養室的光照強度。當光照強度在3 000 lx 以上時，瓶苗生長良好；當光照強度低于3 000 lx時，瓶苗表現不佳，甚至會出現較多的“玻璃苗”，這可能與七寶黃金瓜喜光、喜溫的生物學特性有關。

3 無菌系的生根培養

3.1 生根培養方法

當繼代增殖培養的瓶苗長至高3 cm 左右、無“玻璃苗”產生時，即可進行生根培養，從而培育成完整的“試管苗”。具體方法為：將瓶苗中的“叢生芽”切成單株（因節間處富含生長素類物質，容易生根，故切割時要切在節間處），接種至生根培養基上誘導生根。當生根苗根系長度達1 cm左右時，即可將瓶苗移出培養室，置于常規室溫、自然光照條件下培養24 h，使其適應外界氣候環境。

3.2 生根培養基配方

生根培養基配方以1/2MS+IBA 0.2 mg/L（另加瓊脂粉5 g/L、蔗糖20 g/L、鐵鈉鹽38.23 mg/L，調節pH 至5.8 左右）較為適宜，培養3 周后，其生根率可達99%以上，有時可達100%，且根系為白色、較發達，每株有5～6條根（多的可達10余條根）。值得注意的是，為利于試管苗煉苗馴化及提高成活率，不宜采用NAA 作為生根誘導劑，這是因為采用NAA 作生根誘導劑的瓶苗生根狀況不如采用IBA作生根誘導劑，表現為瓶苗根少、粗短，且會在根基部著生愈傷組織，而當生根培養苗基部產生愈傷組織后，會導致其生根數減少甚至不生根[3]。

3.3 生根培養室管理

生根培養的培養室溫度為24～25 ℃、24 h 恒溫，當90%以上幼苗開始生根、根系長度為0.3 mm時，將培養室溫度調至22～23 ℃，以使根系粗壯飽滿，同時可防止因溫度過高而使葉片蒸騰黃化；光照時間為12 h/d（7:00—19:00），光照強度為3 000～3 500 lx。

4 試管苗的煉苗馴化

4.1 試管苗清洗

用鑷子將生根并適應24 h的試管苗輕輕取出培養瓶，于清水中漂盡根部瓊脂。此階段葉片較脆嫩，操作時需注意不要傷及葉片。

4.2 煉苗基質

煉苗基質以泥炭∶椰糠∶珍珠巖=2∶1∶1（質量比）為好，基質在充分拌和后噴一些清水，以使基質保持濕潤。

4.3 試管苗移栽

穴盤育苗法是目前國內外廣泛應用的育苗技術，尤其在組培育苗中應用較多[4]，故試管苗同樣采用穴盤育苗法進行煉苗馴化。試管苗的移栽時間以2 月下旬—4月下旬為宜，具體操作為：先將充分拌和的基質裝入72孔的硬質塑料穴盤，然后將穴盤置于苗床上；用鑷子或竹片將試管苗筆直淺栽入穴盤基質，栽后立即澆足活棵水；移栽后在苗床上方搭好塑料小環棚，如遇晴熱天氣，需用75%遮光率的黑色遮陽網覆蓋，以防幼苗失水萎蔫。

4.4 煉苗期管理

4.4.1 葉面噴霧補水

鑒于2個親本的試管苗葉片相對較大，但葉片較薄，極易失水萎蔫，故需在移栽后第2天進行葉面噴霧補水。若苗床上方有噴淋裝置，則每天葉面噴霧3～5次，每次噴霧20 s（視天氣情況靈活掌握噴霧次數，陰天噴霧補水1～2次，晴天則相應增加噴霧補水次數）；若無噴淋裝置，可用噴霧器進行葉面噴霧補水。

4.4.2 掌握好適宜的棚內溫度

上海地區春季天氣多變，棚內溫度忽高忽低，對幼苗生長十分不利，因此應根據天氣變化情況，因地制宜地采取應對措施，保障棚內溫度適宜（棚內溫度以24～28 ℃為好，最高不超過30 ℃），以確保幼苗正常生長。

4.4.3 適時追肥

待幼苗長出新根和新葉后，應適時追施速效化肥，以0.5%尿素或三元復合肥（N∶P∶K=15∶15∶15，質量分數）兌水澆灌為好，每月追肥2次，以促進幼苗正常生長。

4.5 穴盤苗適時移栽

當穴盤苗長至高度8 cm以上并具5張以上葉片時，即可將穴盤苗拔出，連帶基質一起移栽至育苗大棚內。