環磷腺苷反應元件結合蛋白在消化系統腫瘤中的作用△

石明連，朱政全，劉永明，蘇何玲

桂林醫學院智能醫學與生物技術學院生物化學教研室，廣西桂林 541004

轉錄因子環磷腺苷反應元件結合蛋白（cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein，CREB）屬于DNA 結合蛋白堿性亮氨酸拉鏈（basic-region leucine zipper，bZIP）超家族成員，通過與基因啟動子的環磷腺苷反應元件（cyclic adenosine monophosphate response element，CRE）結合，啟動具有CRE 序列的靶基因轉錄，調控細胞分化、增殖、凋亡和代謝等生理過程。人CREB基因位于2 號染色體長臂33 區3 帶，編碼含有341 個氨基酸殘基的蛋白。結構上，CREB 蛋白包含多個具有特定功能的結構域，其中bZIP 結構域介導CREB 二聚反應以及對CRE 的識別與結合，激酶誘導結構域（kinase inducible domain，KID）的9 個絲氨酸（Ser）殘基是多種蛋白激酶磷酸化激活CREB 的位點，基本轉錄活性結構域與TATA-結合蛋白協同調控靶基因轉錄，而富含谷氨酰胺結構域則調控CREB 的轉錄活性。對CREB 結合位點的全基因組篩查提示超過4000 個基因受CREB調控[1]。實際上，CREB基因是原癌基因，CREB 是普遍性的轉錄激活因子。有研究應用結合了轉錄組學、秩次超幾何分布重疊和染色質免疫沉淀測序等技術的系統分析方法揭示了與腫瘤有強相關性的CREB 靶基因，其中CREB 上調的靶基因29個，CREB 下調的靶基因20 個，并且CREB 對這些基因表達調控是非依賴環磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的[2]。這表明CREB 不僅與腫瘤高度相關，而且在作為依賴cAMP 的轉錄激活因子的同時，也以非依賴cAMP 的方式對腫瘤細胞的生長發揮促進和抑制的雙重作用。近年來，越來越多的研究指出CREB 在惡性腫瘤的發生發展中發揮非常重要的作用，其中消化系統腫瘤是研究熱點。本文就CREB 在消化系統腫瘤中作用的研究進展進行綜述。

1 CREB 與肝癌（liver cancer，LC）

在LC 的主要類型肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞中，CREB 的表達及其蛋白磷酸化水平均高于正常肝細胞[3]。磷酸化是CREB 激活的主要方式，磷酸化位點主要位于其KID 的9 個Ser 殘基，其中Ser133 的磷酸化是CREB 激活的中心環節。CREB 磷酸化形成二聚體，然后與靶基因啟動子的CRE 結合啟動轉錄。在LC 細胞Huh7中，CREB 蛋白及其Ser133 磷酸化水平的降低可顯著引發細胞的自噬[4]，而CREB 的激活則增強HCC浸潤并與腫瘤的惡性發展相關[5]。CREB 高表達的HCC患者5年生存率顯著低于CREB低表達患者[6]。

CREB 在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關HCC 的發生中也起到促癌作用。機制上，這種促癌作用通過HBV 的非結構蛋白X 調節CREB 相關信號通路，包括細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/CREB[7]、CREB/Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）[8]和CREB/微小RNA（microRNA，miRNA）-3188 信號通路[9]，或者調節CREB 與相關蛋白如中心體p4.1 相關蛋白（centrosomal p4.1-associated protein，CPAP）[10]和皮層肌動蛋白（cortactin，CTTN）[11]的表達和相互作用實現。

盡管越來越多的研究報道CREB 具有促癌作用，但促癌作用并非CREB 對HCC 的全部作用。Li 等[12]分析354 例確診為HCC 患者的HCC 組織和癌旁正常組織標本發現，CREB/線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）低表達與不良臨床結局相關，并導致不良預后。這提示CREB 對HCC 細胞生長也具有抑制作用。實際上，CREB 被發現在多種惡性腫瘤中發揮促癌和抑癌作用，而CREB 發揮促癌或者抑癌作用取決于其作用節點的前后關系[13]。如果CREB 的表達與激活以及由此產生的靶基因轉錄和信號通路的影響可以促進細胞增殖且抑制細胞自噬和凋亡，則CREB 發揮促癌作用，反之就是抑癌作用。

總之，對于HCC，已有的研究顯示CREB 主要是促癌作用。CREB 及其磷酸化水平升高促進HCC 的發生發展。而且，HBV 相關HCC 也是HBV反式調節蛋白非結構蛋白X 通過影響CREB 相關信號通路的致癌結果。鑒于泛腫瘤研究指出CREB 具有促癌因子和抑癌因子雙重性，因此，盡管目前只有個別研究報道CREB 對HCC 具有抑癌作用，但CREB 在HCC 發生發展的什么環節或者什么情況下發揮抑癌作用及其機制將是下一步值得關注的研究問題。

2 CREB 與食管癌（esophageal carcinoma，EC）

研究報道，CREB 對不同病理類型的EC 具有不同的影響。應用KMplot mRNA 基因芯片和RNA-seq analysis（https：//kmplot.com/analysis/）方法分析發現，CREBmRNA 的表達與腫瘤患者的生存率相關。CREB 表達升高和其Ser133 位點磷酸化可降低食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）患者的生存率，并且是腫瘤復發高風險因子。而CREB 高表達對于食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者則是生存有利因素[14-15]。

近年來，非編碼RNA 與CREB 的相互作用在惡性腫瘤發生發展中的作用越來越受到關注。Yao 等[16]報道，miRNA-506 在EC 組織和細胞系中顯著下調。體外分析發現，過表達miRNA-506 可抑制EC 細胞增殖，而抑制miRNA-506 表達則促進EC 細胞增殖。機制上，miRNA-506 是通過靶向CREB基因抑制CREB 轉錄活性，從而發揮抑制EC細胞增殖的作用。Su 等[17]研究指出，在EAC 細胞系中敲低長鏈非編碼RNA LINC00857，可以抑制細胞增殖、集落形成、侵襲和遷移，并誘導細胞凋亡。同時，包括磷酸化CREB 在內的一些癌基因編碼蛋白減少，提示CREB 參與LINC00857 對EAC的致癌作用。Luo 等[18]報道了CREB 與非編碼RNA 相互作用影響EC 發生發展的另一種方式，CREB 和miRNA-133b 分別正向和負向調節β1，3-N-乙酰氨基葡糖轉移酶2（β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2，β3GNT2）的表達，形成β3GNT2 表達的調控環路。β3GNT2 在EC 組織中的表達升高，提示CREB 正向調控增強，β3GNT2 的高表達與EC 患者的不良預后相關。

值得注意的是，盡管高通量技術的基因表達分析顯示CREB 的高表達對ESCC 患者的生存有利，但國內學者的研究指出，CREB 在ESCC 組織中過表達，并與患者的淋巴結轉移和TNM 分期均呈正相關，下調CREB 的表達可抑制ESCC 細胞生長，誘導S期細胞周期停滯，引發細胞凋亡，抑制細胞遷移和侵襲[19]。CREB磷酸化使轉化生長因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）在ESCC 中表達上調，促進腫瘤新生血管生成和轉移[20]。以上研究表明，CREB 的表達與磷酸化在ESCC 中同樣發揮促癌作用。因此，CREB 在EC 中主要是促癌因子，而其抑癌因子的作用目前尚缺少實驗依據。

3 CREB 與胃癌（gastric cancer，GC）

CREB 的表達與GC 患者的預后相關。高表達CREB的GC患者5年生存率顯著降低[6]。Wang等[21]檢測285 例原發性和轉移性GC 組織以及非GC 胃黏膜組織的石蠟包埋標本發現，CREB 在GC 中高表達，且與GC 轉移、腫瘤分期和不良預后相關。除了CREB 高表達對GC 具有促癌作用，CREB 的激活也促進GC 的發生發展。Koh 等[22]報道，β受體阻滯劑普萘洛爾抑制了MKN45 和NUGC3 兩種GC 細胞的CREB 磷酸化激活并阻斷其信號通路，從而抑制細胞增殖，誘導G1期細胞周期停滯和細胞凋亡。CREB 激活還與GC 的化療耐藥有關。Zhang 等[23]利用來自胃癌細胞系的Lgr5+干細胞研究CREB 的激活發現，抑制CREB 磷酸化導致ATP結合盒亞家族G 成員2（初級血型）[ATP binding cassette subfamily G member 2（junior blood group），ABCG2]這種多重藥物轉運蛋白的表達下調是順鉑耐藥的原因之一。另外，Li 等[24]報道，GC 組織中線粒體核糖體蛋白L33（mitochondrial ribosomal protein L33，MRPL33）的短亞型表達上調可通過阻斷磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/CREB 信號通路，誘導細胞凋亡而促進表柔比星反應。而MRPL33 的長亞型則作用相反。

近年來，CREB 與非編碼RNA 相互作用的研究揭示了諸多GC 發生發展的新機制。在GC 組織和細胞中高表達的CREB 通過抑制miRNA-186 的轉錄降低其對角蛋白8（keratin 8，KRT8）mRNA 的靶向作用，從而增加KRT8 對缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達的上調作用，使KRT8/HIF-1α軸作用增強，促進GC 細胞生長并抑制凋亡[25]。而過表達miRNA-450a-5p 則通過下調CREB 抑制GC 細胞增殖、遷移和侵襲[26]。Zhuo等[27]報道了LINC00473 作為癌基因促進GC 發展的模式。LINC00473 一方面靶向水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）mRNA，并通過CREB 增強AQP3 表達，促進GC細胞增殖和遷移；另一方面作為競爭性內源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）在細胞質中以海綿機制作用于miRNA-16-5p，緩解其對細胞周期蛋白D2（cyclin D2，CCND2）的抑制作用，從而增強LINC00473/miRNA-16-5p/CCND2 軸，促進細胞周期和GC 細胞增殖。Lai 等[28]報道，環狀RNA（circular RNA，circRNA）0047905 作為ceRNA海綿化miRNA-4516 和miRNA-1227-5p，解除其對絲氨酸蛋白酶抑制劑家族B 成員5（serpin family B member 5，SERPINB5）和基質金屬蛋白酶11（matrix metalloproteinase 11，MMP11）的抑制。SERPINB5 和MMP11 的過表達與GC 患者的不良預后相關。靶向下調circRNA0047905 可降低CREB 磷酸化，阻斷GC 細胞的AKT/CREB 通路，但由此如何影響GC 的發展尚待研究。

4 CREB 與結直腸癌（colorectal cancer，CRC）

CREB 對維持CRC 細胞的惡性特征具有重要作用。Fujishita 等[29]報道，磷酸化CREB 在有腫瘤轉移的CRC 小鼠和患者中表達。此外，cAMP/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/CREB 通路可上調CRC 腫瘤標志物白細胞激活黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM）和凸素1（prominin 1，PROM1），使CRC 維持腫瘤干細胞特性和轉移潛能。敲除CREB基因將降低CRC細胞的腫瘤形成和轉移起始能力。CREB 還通過調節靶基因葡萄糖轉運體3（glucose transporter 3，GLUT3）[30]和核糖核苷酸還原酶調節亞基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2）[31]

的表達促進CRC 細胞的增殖、遷移和侵襲。亞硒酸鹽可通過阻斷CREB 信號通路，在體外和體內抑制CRC 細胞中B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）引發的細胞凋亡。值得注意的是，盡管雙嘧達莫被報道可以抑制腫瘤細胞的增殖，但在CRC 細胞HCT-8 中，雙嘧達莫可能通過誘導CREB 磷酸化促進細胞的增殖[32]。

CREB與非編碼RNA的相互作用在CRC細胞惡變中具有重要影響。其中miRNA-101、miRNA-134和miRNA-205 等miRNA 對CREB 的靶向作用可下調CREB 的表達，弱化CREB 信號通路，抑制CRC細胞增殖和遷移[33-35]。例外的是，miRNA-150 對CREB 信號通路的抑制則促進CRC 細胞的侵襲和遷移[36]，這種現象值得關注與深入研究。circRNA在CRC 中起到癌基因的作用。circ_0079993、circ_0136666、circ_002178 和circ_0006357 等circRNA 被報道促進CRC 細胞的增殖[37-40]。實際上，它們是作為ceRNA 以海綿機制分別作用于miRNA-203a-3p、miRNA-383、miRNA-542-3p 和miRNA-133b，消除其對CREB 的靶向作用，從而增強CREBmRNA 的穩定性和CREB 表達，促進CRC 的發展。非編碼RNA 以miRNA 靶向下調CREB 表達，并以circRNA 作為ceRNA 海綿化消除miRNA 對CREB 的靶向下調作用是CREB 影響腫瘤發生發展的重要機制。

5 CREB 與其他消化系統腫瘤

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）中CREB 的表達影響腫瘤的發生發展。Song 等[41]報道，長鏈非編碼RNA LINCO0857 通過間充質-上皮細胞轉化（mesenchymal- epithelial transition，MET）上調CREB 和信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）的表達，促進PC 細胞的增殖，CREB 的激活促進PC 細胞生長。CREB 是鋅依賴的轉錄因子，被鋅轉運蛋白4（zinc transporter 4，ZIP4）激活。Zhang 等[42]報道，PC 細胞中ZIP4 對CREB 的激活可增加具有癌基因功能的miRNA-373 的表達，進而下調腫瘤蛋白p53 可誘導核蛋白1（tumor protein p53 inducible nuclear protein 1，TP53INP1）、大腫瘤抑制因子激酶2（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）以及CD44 的表達，促進PC 的發展。膠原蛋白Ⅺα1（collagen type Ⅺalpha 1 chain，COL11A1）對CREB的激活是通過誘導AKT 磷酸化，提升CREB 的Ser133 水平，因此增強AKT/CREB 信號，并通過AKT/CREB/Bcl-2/Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）信號通路抑制線粒體跨膜功能，促進PC 細胞增殖并抑制其凋亡[43]。CREB 激活促進PC 轉移，致癌蛋白Kirsten 鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）增加磷酸化激活的CREB 的Ser133 水平，CREB 的Ser133 與突變型p53和CREB相互作用，上調轉移前先驅轉錄因子叉頭框蛋白A1（forkhead box A1，FOXA1），激活其轉錄網絡，驅動PC細胞的轉移[44]。CREB 激活還與PC 患者的低生存率相關。Srinivasan 等[45]報道，煙草致癌物誘導的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）介導CREB 磷酸化，使吸煙者的CREB 激活水平顯著升高，促進PC 細胞的生長，降低PC 患者的生存率。與上述CREB 磷酸化對PC 的影響相反，CREB 去磷酸化抑制PC 細胞的增殖。PH 域富含亮氨酸重復蛋白磷酸酶2（PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase 2，PHLPP2）誘導CREB 去磷酸化，下調細胞周期蛋白D1（cyclin D1），抑制PC 細胞增殖。Wu 等[46]報道了CREB 亞型CREB3 對另一種消化系統腫瘤膽囊癌（gallbladder cancer，GBC）的作用。miRNA-181b 靶向CREB3 調節因子（CREB3 regulatory factor，CREBRF），解除其對CREB3 的抑制與降解作用，由此促進GBC 的病理性發展，并阻斷抗腫瘤藥物人參皂苷RG3 對GBC細胞增殖和腫瘤生長的抑制作用?，F有研究資料表明，CREB在消化系統其他腫瘤中主要顯示癌基因屬性，其表達與激活促進腫瘤的發生發展，但其作用網絡和作用機制則具有復雜性。

6 小結與展望

綜上所述，CREB 在HCC、EC、GC、CRC 和PC等消化系統腫瘤中主要發揮促癌因子的作用。大多數情況下，消化系統腫瘤組織中CREB和p-CREB水平升高，并與細胞增殖、凋亡抑制和患者的不良預后相關。盡管目前有關CREB 在消化系統腫瘤中抑制腫瘤發生發展的報道較少，但由于泛腫瘤研究發現CREB 具有促癌因子和抑癌因子雙重性，所以CREB 在消化系統腫瘤中發揮抑癌作用及其機制應該是未來值得關注的研究問題。近年來，CREB 與非編碼RNA 相互作用對消化系統腫瘤細胞生長影響的研究報道快速增加，揭示了諸多新的CREB 相關促癌和抑癌機制，也為消化系統腫瘤提供了新的潛在診斷和預后標志，以及潛在靶點。腫瘤患者存在廣泛的代謝異質性，因此對CREB 在腫瘤中作用網絡和作用機制的深入研究可能產生復雜的結果，但對于精準和個性化的腫瘤治療卻十分必要。