紙莢豆不定根不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

王 淼, 劉亮亮, 葉瑋琦, 于 碩, 張宏妍, 廉美蘭, 樸炫春

(延邊大學 農學院,吉林 延吉 133002)

紙莢豆(Lessertiafrutescens)屬豆科多年生灌木植物,產于非洲南部炎熱干旱的地區,是南非重要的藥用植物之一[1]。紙莢豆富含三萜皂苷、多糖、松醇、氨基酸、黃酮等多種活性物質[2-4],可用于治療創傷、感染、發熱、消化不良、癌癥及糖尿病、胃病等各類疾病[5-6]。由于紙莢豆具有如此豐富的藥理活性,使其在南非地區作為常用植物藥使用,且需求量巨大[7]。然而,現階段紙莢豆自然資源僅生長于非洲南部區,同時由于人為過度采集導致紙莢豆自然種群數量不斷下降,加上人工栽培過程中種子發芽率低等原因,使紙莢豆植物材料滿足不了社會需求[6]。生物反應器培養是由植物組織培養技術發展而來的一種新興技術,能夠不受季節、時間、環境因素的限制實現周年化快速生產植物材料及其目標產物。Shaik等[8]使用生物反應器嘗試進行紙莢豆組培苗培養,但在培養過程中極易產生玻璃化現象,不利于大規模工廠化生產。相比之下,不定根培養具有明顯的穩定性和高效性,可以在短期內大量獲得與母體植株活性物質含量相似的植物材料,可作為改善傳統材料來源獲取的有效途徑。該研究團隊利用生物反應器進行紙莢豆不定根培養并發現這種方法可行。

現代醫學研究表明,過量自由基的產生往往與許多的慢性病和衰老緊密相關[9-10],抗氧化可以有效減輕自由基對人體的危害程度,因此,抗氧化相關產品的研發已然成為了醫療、保健、化妝品產業的熱點之一[11]。目前針對抗氧化作用的相關研究機制主要包括清除自由基、形成金屬離子配合物、消除活性氧等[12]。該研究通過測定紙莢豆粗提物及其5種萃取物的(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)DPPH自由基清除能力、(2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除能力、鐵離子螯合能力及鐵離子還原能力,并利用優劣解距離法(TOPSIS)對它們的綜合抗氧化能力進行比較,為今后紙莢豆不定根應用于相關抗氧化產品的開發生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料及提取

參照劉懿萱等[13]的方法培養紙莢豆不定50 d后,收獲不定根,洗去表面培養基后在45 ℃恒溫烘干箱中烘干,收集不定根干品作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 紙莢豆不定根粗提物和不同萃取物的制備

1) 粗提物的制備:將100 g不定根干品浸泡在60%乙醇[液料比為40∶1 (mL∶g)]中,同時添加3 g纖維素酶,pH值調為5,55 ℃熱水提取1 h后,于90 ℃水浴中滅活5 min,抽濾,收集濾渣,濾渣使用60%乙醇[液料比為42.53∶1 (mL∶g)]閃式提取1 min,提取2次,將每次抽濾的濾液進行合并,真空冷凍至干燥,即得不定根粗提物,用于后續試驗。

2) 萃取物的制備:將上述所得不定根乙醇粗提物,取40 g 用蒸餾水定容至400 mL,倒入體積為2 000 mL的分液漏斗,并加入800 mL石油醚,震蕩24 h后,充分搖勻,靜止分層后取上層溶液即為石油醚萃取液;繼續收集下層溶液并倒入200 mL分液漏斗中,加入800 mL二氯甲烷,震蕩24 h后,充分搖勻,靜止分層后取上層溶液即為二氯甲烷萃取液;繼續收集上層溶液,倒入2 000 mL分液漏斗中,加入400 mL乙酸乙酯,震蕩24 h后,充分搖勻,靜止分層后取上層溶液即為乙酸乙酯萃取液;繼續收集下層溶液,加入400 mL正丁醇溶液,震蕩24 h,充分搖勻,靜止分層后取下層溶液即為正丁醇萃取液,并收集上層水溶液(以上萃取過程重復2次)。分別將石油醚萃取物(PET-F)、二氯甲烷萃取物(DCM-F)、乙酸乙酯萃取物(EtOAC-F)、正丁醇萃取物(n-BuoH-F)以及水層萃取物(AQ-F)置于真空冷凍干燥機,干燥至恒重后,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測定

參考田文等[14]的方法,測定不定根不同提取物對DPPH自由基的清除能力,依次配置樣品濃度為0.063、0.13、0.25、0.5、1和2 mg/mL,分別吸取0.1 mL上述樣品至96孔板中,加入0.1 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH(北京索萊寶科技有限公司,中國)溶液,避光反應30 min,以甲醇溶液作對照組,利用酶聯免疫檢測(Multiskan FC,賽默飛,上海,中國)在517 nm處測定吸光度,計算DPPH自由基清除能力。

1.2.3 ABTS+自由基清除能力測定

參照高原等[15]的方法測定不定根不同提取物對ABTS自由基的清除能力。配置2.45 mmol/L過硫酸鉀(北京索萊寶科技有限公司,中國)和7 mmol/L的ABTS(上海源葉生物科技有限公司,中國)混合溶液。避光靜置16 h,使用前須將ABTS工作液稀釋吸光值至0.700(±0.02)(734 nm)。配置濃度為0.063、0.13、0.25、0.5、1和2 mg/mL 的樣品2 mL,取樣品溶液 0.1 mL和3.9 mL ABTS工作液于試管中,對照組用3.9 mL去離子水代替ABTS工作液,以加入3.9 mLABTS工作液和0.1 mL無水甲醇為空白組。避光反應6 min,使用紫外分光光度計在吸光度為734 nm下測得吸光值,計算ABTS自由基清除能力。

1.2.4 羥基自由基清除能力研究

根據劉榮等[16]的方法,配置濃度為0.25、0.5、1、2、4和8 mg/mL樣品30 μL于96孔板中,依次加入30 μL 10 mmol/L水楊酸,2.5 mmol/L鹽酸,3.6 mmol/L硫酸鐵,0.88 mmol/L過氧化氫,空白組用蒸餾水替代,避光反應20 min,510 nm處測吸光值,計算羥基自由基清除能力。

1.2.5 Fe2+螯合能力測定

參照馬文芳等[17]的方法,對不定根不同提取物的鐵離子螯合能力進行測定。配置濃度為0.13、0.25、0.5、1、2和4 mg/mL的待測樣品溶液。配置濃度為2 mmol/L的FeCl2溶液和濃度為5 mmol/L的菲洛嗪(上海源葉生物科技有限公司,中國)溶液。在96孔板中分別加入 50 μL待測樣品,加入137.5 μL蒸餾水,2.5 μL的FeCl2溶液,在震蕩速度為300 r/min下搖勻后加入10 μL的菲洛嗪溶液,室溫下靜置10 min。對照組以2.5 μL 蒸餾水代替FeCl2溶液,空白組以50 μL蒸餾水代替樣品,利用酶聯免疫檢測儀在562 nm 處測吸光值,計算鐵離子螯合能力。

1.2.6 Fe3+還原能力研究

根據吳夏青[18]的方法,配置濃度0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5和1 mg/mL的樣品溶液,取0.5 mL于試管中,配置pH值為6.6的0.2 mol/L PBS緩沖液0.5 mL和1%K3[Fe(CN)6]溶液0.5 mL,充分混勻,37 ℃條件下孵60 min,冷卻至室溫后加10%氯乙酸(TCA)溶液0.5 mL,混勻后,于700 nm處使用分光光度計測量吸光值,隨后加入0.1% Fecl3溶液0.5 mL,混勻后,于700 nm處測量吸光值,空白對照組即為將樣品替換為相同體積的PBS,根據吸光值計算鐵離子還原能力。

1.2.7 抗氧化能力綜合評價

為了綜合評價6種不同提取物的抗氧化能力,利用5種抗氧化評價方法(DPPH、ABTS、羥基自由基清除能力,鐵離子還原、螯合能力)中得到的提取物的半最大效應濃度(EC50)進行了TOPSIS分析[19]。具體步驟為:

1) 建立初始矩陣(X):利用6種提取物(a)的5種抗氧化活性(b)的EC50值,建立5×6的初始矩陣(圖1A)。

圖1 TOPSIS分析

2) 建立標準化矩陣(Y):將X歸一化處理,即得Y(圖1B)。

1.3 數據分析

所有試驗處理均采用3次重復。試驗數據使用SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago,IL, USA) 進行方差分析,采用鄧肯式新復極差法進行多重比較,顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 紙莢豆不定根粗提物和不同萃取物對DPPH自由基清除能力的影響

紙莢豆不定根粗提物及5種萃取物均對DPPH自由基有顯著的清除能力,并且提取物與萃取物的濃度與DPPH自由基清除能力呈正相關(圖2)。其中,DCM表現出最高的清除能力,在濃度為2 mg/mL時,清除率達到86%,濃度同為2 mg/mL,DCM-F效果是清除率表現較弱的AQ-F的1.28倍。

注:CE=粗提取,PET-F=石油醚萃取層,DCM-F=二氯甲烷萃取層,EtOAC-F=乙酸乙酯萃取層,n-BuOH-F=正丁醇萃取層,AQ-F=水層。不同字母表示P<0.05水平的顯著性差異,下同。

2.2 紙莢豆不定根粗提物和不同萃取物對ABTS自由基清除能力的影響

由圖3可知,不同提取物清除ABTS自由基的能力, 在一定濃度范圍內 (0.062 5～2 mg/mL) 存在量效關系。DCM-F清除效果最強,在濃度為2 mg/mL時,清除率達到了75%,AQ-F清除效果較弱,DCM-F是AQ清除效果的1.68倍。

圖3 不同提取物對ABTS自由基的清除率

2.3 紙莢豆不定根粗提物和不同萃取物對羥基自由基清除能力的影響

對不定根羥基自由基清除能力進行測定后發現(圖4),6種提取物均對羥基自由基有一定的清除能力,并且清除能力與提取物濃度呈依賴性增加。經分析對比可知,PET-F對羥基自由基清除的能力最優秀,當濃度為2 mg/mL時,對羥基自由基的清除能力為56%,顯著高于同等提取物濃度下的其他5種提取物對羥基自由基的清除能力,濃度為2 mg/mL時,DCM-F的清除能力為53%,AQ-F為47%,而n-BuOH-F與EtOAC-F清除效果相似,分別為42%和43%,在提取物濃度為2 mg/mL時,CE的效果較差,清除率為31%。

2.4 紙莢豆不定根粗提物和不同萃取物對鐵離子螯合能力的影響

由圖5可知,紙莢豆不定根粗提物和5種萃取物均是良好的鐵離子螯合劑,隨著萃取物濃度的升高,鐵離子螯合能力也逐漸增強。螯合能力最好的是DCM,當濃度達到4 mg/mL時,其鐵離子螯合率為98%,EtOAC-F及PET-F在相同濃度下,鐵離子螯合率略弱于DCM-F,分別為95%和94%。n-BuOH-F、AQ-F、CE在4 mg/mL濃度下的螯合能力與其他3種萃取物的螯合能力具有一定差距,螯合率分別為88%、83%和63%。

圖5 不同提取物的鐵離子螯合力

2.5 紙莢豆不定根粗提物和不同萃取物對鐵離子還原能力的影響

由圖6可知,粗提物和5種萃取物均表現出良好的鐵離子還原能力,且還原能力與樣品濃度呈正相關。經對比可知,對鐵離子還原能力最好的是EtOAC-F,當樣品為最大濃度1 mg/mL時,還原力為80%,顯著高于其他5種樣品,樣品濃度相同時,EtOAC的清除效果分別是DCM-F、PET-F、AQ-F、CE-F和n-BuOH-F的1.11、1.22、1.23、1.30和1.54倍。

2.6 紙莢豆不定根提取物抗氧化綜合能力評價

由半最大效應濃度(EC50)可知(表1),紙莢豆不定根粗提取物及5種萃取物均有一定程度的抗氧化活性,DCM-F在清除DPPH自由基和ABTS自由基均表現出較強的清除能力,具有較強的鐵離子螯合能力。而EtOAC-F的鐵離子還原能力最強,對羥基自由基的清除能力指標評測中可以看出,PET-F表現較好。

TOPSIS綜合評價是對原始矩陣進行標準化處理,確定最優解與最劣解,計算得到貼近度,根據貼近度的大小,對各提取物綜合抗氧化能力排序,明確抗氧化效果最佳的提取物,根據TOPSIS綜合評價結果(表2)可以明顯看出,二氯甲烷萃取物的綜合抗氧化能力更貼近于正理想解,與正理想解的距離0.119 5,貼近度C為0.933 5,相反正丁醇萃取物與水萃取物的綜合抗氧化能力更遠離于正理想解,貼近度C分別為0.587 3和0.262 3,并根據其貼近度對6種提取物的抗氧化綜合能力進行排序。由此表明,在抗氧化綜合能力上,DCM-F的綜合抗氧化能力較高,其次是PET-F。

表2 TOPSIS法綜合評價不同提取物的抗氧化能力

3 討論與結論

天然抗氧化劑可絡合促氧化的金屬離子,有效抑制自由基的產生,促進抗氧化酶和抗氧化因子的產生,植物提取物可以作為一種綠色高效的抗氧化劑[20-25]。但有研究發現,不同有機溶劑逐級萃取的萃取層的抗氧化活性有很大差異,如譚亮等[26]研究發現,黃秋葵乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基能力明顯強于黃秋葵水層萃取物,甄兆孟等[27]研究發現,非洲白參二氯甲烷萃取物清除ABTS自由基能力顯著強于非洲白參水層萃取物。

對于紙莢豆而言,其不定根抗氧化能力的研究至今尚未報道,該試驗研究發現,生物反應器培養的紙莢豆不定根粗提物及5種萃取物的抗氧化能力均隨著提取物濃度的升高而增強,并且DCM-F在DPPH自由基清除能力,ABTS自由基清除能力,鐵離子螯合能力上具有較好的效果,EtOAC-F在鐵離子還原力上具有較好的效果,而在羥基自由基清除能力中表現較好的則是PET-F。這可能是由于在萃取過程中紙莢豆不定根中的活性物質在不同的萃取劑中溶解度不同使其表現出不同的抗氧化能力,且有研究表明,培養的紙莢豆不定根含有三萜皂苷和多糖等生物物質[13],而三萜皂苷類物質已被證實具有抗氧化活性,如周靜等[28]研究表明,鐵破鑼中3種三萜皂苷均具有較強的體外抗氧化活性,根據先前研究,紙莢豆不定根粗提物及萃取層中DCM-F的三萜皂苷含量最高,達到了356.47 mg/g,因此,推測該研究結果DCM-F綜合抗氧化活性最好的原因可能是由于三萜皂苷類物質主要集中在DCM-F中。

在抗氧化研究中不同的抗氧化指標可能會存在不同的評價結果,面對這種情況選擇一種綜合評價的方法來進行選擇,而TOPSIS是多個目標決策分析時的一種高效方法,它通過對評價因素與最優解、最劣解的貼近度來進行排序分析,若某因素最貼近最優解的同時又遠離最劣解,則判斷該因素為最好;否則不為最優,與同樣常用于解決多屬性決策問題的方法相比,TOPSIS較為客觀[29-30]。使用該方法應用于抗氧化能力的綜合分析則可以清晰明了地比較判斷出樣品間的優劣情況。該試驗采用TOPSIS綜合分析紙莢豆不定根粗提取物和5種萃取物的抗氧化綜合能力,得到的貼進度最終排序為DCM-F>PET-F>EtOAC-F>CE>n-BuOH-F>AQ-F,表明DCM-F的抗氧化能力較強,并且通過分析可知,TOPSIS法也可以在評價抗氧化綜合能力時作為一種有效的技術手段,為后續抗氧化試驗的開展及理論依據提供新思路。