繡球菌多糖粗提物對小鼠抗疲勞作用的研究

李佳鑫, 丁蘭卉, 李 姣, 匡 明,2, 金永燮,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 食品工程學(xué)院;2.吉林省釀造技術(shù)科技創(chuàng)新中心:吉林 吉林 132101)

繡球菌(Sparassiscrispa),又名繡球蕈、繡球菇,隸屬于擔(dān)子菌亞門、異隔擔(dān)子菌綱、無(非)褶菌目、繡球菌科、繡球菌屬,因其形似巨大繡球而得名[1]。繡球菌是一種營養(yǎng)豐富,功效作用強(qiáng)大,非常珍稀名貴的野生食用菌,不僅味道鮮美,營養(yǎng)價值高,子實體中含有的β-葡聚糖可以提高人體免疫力、強(qiáng)化機(jī)體造血功能,而且還具有抗癌、防癌、抗艾滋病等功效[2-6]。近年來,由于它具有免疫調(diào)節(jié)、提高造血功能等功效,而逐漸成為研究熱點,通過深層次研究,挖掘出繡球菌的更多應(yīng)用價值。

多糖分布廣泛,在高等植物、細(xì)菌、真菌[7],藻類以及動物體內(nèi)含量豐富。多糖除具有免疫調(diào)節(jié)功能外還具有抗病毒、抗感染、抗輻射、抗凝血、降血糖、降血脂、消除氧化自由基[8],促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成等作用[9]。多糖已被認(rèn)為是除核酸和蛋白質(zhì)之外另一重要的生命物質(zhì)。對多糖生物活性的研究越深入,多糖的生物活性機(jī)制及功效因子會更加明確, 應(yīng)用領(lǐng)域也會更加寬廣[10]。

繡球菌多糖提取物的抗疲勞作用和機(jī)制尚不明確,該研究通過建立力竭運(yùn)動小鼠模型來考察繡球菌多糖的抗疲勞作用及機(jī)制,以期揭示繡球菌多糖作為新型營養(yǎng)補(bǔ)充劑的開發(fā)價值。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

1) 實驗動物:健康ICR小鼠,雄性,5周齡,體質(zhì)量22～24 g,40只,購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2020—0002,質(zhì)量合格證號:01021686806305570。動物實驗嚴(yán)格遵循動物倫理原則,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(審批號:20231023)。

2) 繡球菌:市售;繡球菌多糖:自提;乳酸(lactic acid,LD)、糖原(glycogen,GLY)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所有限公司;肌酸激酶(creatine kinase ,CK)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)測定試劑盒:深圳邁瑞動物醫(yī)療科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)(TG16-WS):長沙東旺實驗儀器有限公司;超低溫保存箱 (DW-86L388A):青島海爾特種電器有限公司;臺式歧管式凍干機(jī)(BTP-3ESE0X):美國SP SCIENTIFIC公司;電子分析天平(ES-E210B):天津市德安特傳感技術(shù)有限公司;轉(zhuǎn)棒疲勞儀(SA102):江蘇賽昂斯生物科技有限公司;小動物游泳桶(SA):江蘇賽昂斯生物科技有限公司;動物跑臺(SA101B):江蘇賽昂斯生物科技有限公司;全自動生化分析儀(BS-240VET):深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;酶標(biāo)儀(INFINITE 200 PRO):美國SP SCIENTIFIC 公司。

2 方法

2.1 繡球菌多糖的制備

工藝流程:新鮮繡球菌→洗凈→切塊→干燥→粉碎→過篩→稱取繡球菌干粉→加入蒸餾水→超聲波萃取→收集提取液→減壓抽濾濃縮→醇析→離心→冷凍干燥→繡球菌多糖

2.2 分組及給藥

分組及灌胃:40只小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),溫度(23±1) ℃,相對濕度(50±5)%,明暗周期12 h,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。小鼠于實驗環(huán)境條件下適應(yīng)1周后,隨機(jī)分為繡球菌多糖提取物高400 mg/kg(H)、中200 mg/kg(M)、低100 mg/kg(L)劑量組和對照組(C),每組10只。高、中、低3組的提取物溶液于每日指定時間灌胃,灌胃體積10 mL/kg。對照組給予等體積生理鹽水灌胃,連續(xù)灌胃32 d,灌胃后第20天開始進(jìn)行小鼠爬桿練習(xí),第22天正式進(jìn)行爬桿試驗;從第23天開始進(jìn)行跑臺力竭試驗,共7 d;第31天進(jìn)行小鼠負(fù)重游泳試驗,其間小鼠自由攝食和飲水[11]。

2.3 抗疲勞試驗

第22天灌胃繡球菌多糖提取物溶液30 min后,把40只小鼠放到鐵架臺的最上端,使小鼠的四肢肌肉處于緊張狀態(tài)。并記錄小鼠跌落的時間,在第3次跌落后結(jié)束爬桿試驗,3次跌落時間的平均值則為小鼠的爬桿時間。根據(jù)爬桿試驗評估多糖提取物溶液對小鼠耐力的影響[12]。第23天灌胃繡球菌多糖提取物溶液30 min后,對4組小鼠進(jìn)行跑臺力竭試驗,并記錄小鼠力竭時間,跑臺力竭試驗進(jìn)行7 d。根據(jù)跑臺力竭試驗評估多糖提取物溶液對小鼠耐力的影響[13]。最后1 d測定完跑臺力竭實驗后休息1 d,每組隨機(jī)取小鼠2只進(jìn)行力竭游泳試驗。在小鼠尾根部負(fù)荷鉛皮,其重量約為小鼠體重的5%,小鼠放于游泳箱(水深約30 cm,水溫約25 ℃),保持小鼠四肢運(yùn)動,每次訓(xùn)練30 min。小鼠入水開始計時,當(dāng)小鼠頭部入水7 s而不能自行浮出水面為體力耗竭,計時結(jié)束,此段時間記為小鼠游泳時間。根據(jù)力竭游泳試驗評估多糖提取物溶液對小鼠耐力的影響[14]。

2.4 抗疲勞指標(biāo)檢測

第32天給予受試物40 min后,將各組小鼠置于水溫30 ℃的自制游泳箱,不負(fù)重游泳30 min撈出,休息30 min后立即斷頭采血,使用離心機(jī)3 500 r/min離心 15 min,分離血清備用;采血后的小鼠立即摘取肝臟備用,分析儀按照測試盒說明測定BUN[15],CK,LDH含量[16]。分別稱取一定量的肝臟置于15 mL 玻璃勻漿管內(nèi),生理鹽水漂洗后處理,超聲粉碎制得10%組織勻漿,按照試劑盒說明測定肝糖原、乳酸含量[17]。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20版本數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用單因素方差分析,數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,當(dāng)P<0.05時數(shù)據(jù)有顯著性差異,當(dāng)P<0.01時數(shù)據(jù)有極顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 繡球菌多糖對小鼠體質(zhì)量的影響

小鼠體質(zhì)量的變化可以直接反映小鼠生長發(fā)育狀態(tài),也可以間接體現(xiàn)繡球菌多糖在飼養(yǎng)期間對小鼠的體質(zhì)量影響。各組小鼠體質(zhì)量變化如圖1所示。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后各組小鼠體質(zhì)量均有所升高,為(25.94±0.97) g,由圖1可知,在繡球菌多糖灌胃期間各組小鼠體質(zhì)量逐漸增長且與對照組小鼠無明顯差異;小鼠日常活動無影響,毛發(fā)無明顯脫落,眼神有光澤,四肢伸展正常,說明繡球菌多糖對其生長發(fā)育無不良影響。

3.2 繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動時間的影響

爬桿試驗,跑臺試驗,負(fù)重游泳試驗是測試小鼠體能、耐力、運(yùn)動損傷等重要的試驗方法,也是評價小鼠抗疲勞的最有效方法[16]。此次試驗通過評估小鼠力竭時間來判斷繡球菌多糖對小鼠抗疲勞的影響,小鼠力竭時間如表1所示。

表1 各組小鼠力竭時間

由表1可知,低(L)、中(M)、高(H)劑量組的小鼠平均爬桿時間均高于對照組(C),中劑量組(L)具有顯著性差異(P<0.05),高劑量組(H)具有極顯著性差異(P<0.01)。在小鼠跑臺體能測試中,與對照組(C)相比,低劑量組(L)、中劑量組(M)和高劑量組(H)的小鼠跑臺時間逐步增加。其中,與對照組(C)相比,低劑量組(L)、中劑量組(M)和高劑量組(H)分別具有極顯著性差異(P<0.01)。在小鼠力竭游泳實驗中,與對照組(C)相比,低劑量組(L)、中劑量組(M)、高劑量組(H)的小鼠游泳時間逐漸增加。與對照組(C)相比,低劑量組(L)具有顯著性差異(P<0.05),中劑量組(M)和高劑量組(H)均具有極顯著性差異(P<0.01)。說明繡球菌多糖可以增加小鼠耐力,延長小鼠力竭時間,有明顯的抗疲勞作用,且力竭時間隨著繡球菌多糖灌胃濃度升高而延長。

3.3 繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動后體內(nèi)肝糖原含量的影響

當(dāng)糖原不能被機(jī)體直接吸收時糖原會儲存在機(jī)體肝細(xì)胞中,當(dāng)機(jī)體運(yùn)動強(qiáng)度增加時肝糖原降解成葡萄糖維持機(jī)體系統(tǒng)平衡,為機(jī)體運(yùn)動提供能量,抵抗疲勞。因此,測試小鼠機(jī)體內(nèi)的肝糖原含量可有效反應(yīng)小鼠運(yùn)動抗疲勞狀況。經(jīng)過檢測,小鼠力竭運(yùn)動后的體內(nèi)肝糖原含量如圖2所示。

注:**表示與對照組相比差異極顯著,P<0.01,下同。

由圖2可知,小鼠力竭運(yùn)動后不同繡球菌多糖劑量組與比對照組相比,肝糖原有所增加,與對照組(C)相比繡球菌多糖低劑量組(L)并無明顯差異性(P>0.05),但繡球菌多糖中劑量組(M)具有極顯著差異(P<0.01)。經(jīng)過中劑量組與對照組(C)比較,可以證明繡球菌多糖能有效堆積肝糖原,提高小鼠的抗疲勞能力。

3.4 繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動后肝組織中乳酸含量的影響

當(dāng)機(jī)體處于長時間高強(qiáng)度負(fù)荷時,機(jī)體會在運(yùn)動開始時產(chǎn)生大量乳酸,但隨著時間流逝,機(jī)體耗氧速率達(dá)到穩(wěn)態(tài)乳酸生成速率就會下降但仍會產(chǎn)生堆積。乳酸堆積直接引起運(yùn)動疲勞。小鼠力竭運(yùn)動后體內(nèi)乳酸含量可以反映出繡球菌多糖對緩解小鼠運(yùn)動疲勞的能力。經(jīng)過檢測小鼠力竭運(yùn)動后肝組織中的乳酸含量如圖3所示。

圖3 各組小鼠乳酸含量情況

由圖3可知,與對照組(C)相比,繡球菌多糖各劑量組的乳酸含量呈現(xiàn)下降趨勢,其中,繡球菌多糖低劑量組(L)的乳酸含量與對照組(C)相比,減少且呈極顯著差異(P<0.01),繡球菌多糖中劑量組(M)的乳酸含量比低劑量組(L)少且和對照組(C)具有極顯著差異(P<0.01),繡球菌多糖高劑量組(H)與其他3組相比,乳酸含量最少且和對照組(C)具有極顯著差異(P<0.01)。以上情況可有效反映繡球菌多糖能緩解乳酸堆積狀況,具有抗疲勞作用且隨著繡球菌多糖濃度增高效果更加明顯。

3.5 繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動后血清中乳酸脫氫酶含量的影響

在機(jī)體劇烈運(yùn)動中機(jī)體體內(nèi)的乳酸脫氫酶含量會逐漸增加,機(jī)體產(chǎn)生乳酸需要乳酸脫氫酶緩解,在細(xì)胞缺少氧氣供應(yīng)的情況下要讓機(jī)體持續(xù)供能就要由乳酸脫氫酶釋放氫以產(chǎn)生NAD+來制造ATP,保證運(yùn)動進(jìn)行。經(jīng)過檢測小鼠力竭運(yùn)動后血清中乳酸脫氫酶含量來判斷繡球菌多糖對小鼠運(yùn)動耐力的影響。經(jīng)檢測小鼠血清中乳酸脫氫酶含量如圖4所示。

由圖4中可以看出,與對照組(C)相比,其他繡球菌多糖劑量組的乳酸脫氫酶含量均有所升高,其中,繡球菌多糖中劑量組(M)與對照組(C)具有顯著性差異(P<0.05)。繡球菌多糖低劑量組(L)和中劑量組(M)之間的LDH含量差異較小,繡球菌多糖高劑量組(H)由于運(yùn)動損傷導(dǎo)致個體差異較大使標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值較大,不具有顯著性差異。經(jīng)過分析,可以推測出繡球菌多糖對小鼠抗疲勞運(yùn)動具有緩解作用。

3.6 繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動后血清中肌酸激酶含量的影響

肌酸激酶在機(jī)體中促進(jìn)能量代謝,比如促進(jìn)ATP(三磷酸腺苷)轉(zhuǎn)化成ADP(二磷酸腺苷),在小鼠力竭運(yùn)動過程中肌酸激酶促進(jìn)生成磷酸肌酸,其具有的高能磷酸鍵是肌肉收縮的能量來源,所以檢測小鼠血清中的肌酸激酶含量可以解釋繡球菌多糖在小鼠力竭運(yùn)動中起到的抗疲勞作用。經(jīng)檢測小鼠血清中肌酸激酶含量如圖5所示。

從圖5可以看出,各組小鼠血清中的肌酸激酶含量呈上升趨勢,對照組(C)和繡球菌多糖低劑量組(L)、中劑量組(M)均不具有顯著差異,但對照組(C)和繡球菌多糖高劑量組(H)具有顯著性差異(P<0.05),且隨著繡球菌多糖劑量的增加各組小鼠血清中肌酸激酶的含量也有所上升。經(jīng)過分析,可以推測繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動具有抗疲勞作用。

3.7 繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動后血清尿素氮含量的影響

當(dāng)機(jī)體經(jīng)過長時間運(yùn)動而無法提供足夠多的糖、脂肪來分解代謝提供能量時,蛋白質(zhì)和氨基酸的分解會逐漸加強(qiáng),機(jī)體中血清尿素氮會隨運(yùn)動增多,機(jī)體越無法承受運(yùn)動負(fù)荷,尿素氮會堆積更多。血清尿素氮含量也從側(cè)面反映出機(jī)體的運(yùn)動耐力,此試驗通過檢測血清尿素氮來解釋繡球菌多糖對小鼠的抗疲勞作用,經(jīng)檢測血清尿素氮含量如圖6所示。

圖6 各組小鼠尿素氮含量情況

通過觀察圖6發(fā)現(xiàn),各小組的血清尿素氮呈下降趨勢,其中,繡球菌多糖低劑量組(L)、中劑量組(M)、高劑量組(H)均與對照組(C)有極顯著差異(P<0.01)。隨著繡球菌多糖劑量濃度的增加,各組小鼠的血清尿素氮含量降低,體現(xiàn)出繡球菌多糖對小鼠力竭運(yùn)動具有一定的抗疲勞作用。

4 結(jié)論與討論

疲勞是一種日常普遍但未受到高度重視的疾病狀態(tài)。常用的抗疲勞試驗方法有負(fù)重游泳試驗[18]、爬桿試驗、Morris水迷宮實驗等;生化指標(biāo)有乳酸、尿素氮、糖原、肌酸激酶等用來評價疲勞程度及抗疲勞功效的判斷[19]。該研究發(fā)現(xiàn),繡球菌多糖可有效增加小鼠運(yùn)動時間,且隨著繡球菌多糖攝入量的增加,效果越明顯。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析,推測出繡球菌多糖可增加小鼠機(jī)體內(nèi)的糖原儲量,小鼠進(jìn)行運(yùn)動時身體中有足夠的糖原消耗[20],能增加運(yùn)動時間,緩解疲勞狀態(tài),提升耐力[21]。繡球菌多糖可以減少小鼠運(yùn)動過程中產(chǎn)生的乳酸,乳酸堆積引起疲勞[22],所以繡球菌多糖能減緩小鼠的疲勞速度達(dá)到抵抗疲勞。繡球菌多糖能提高乳酸脫氫酶和肌酸激酶的活性,在儲存能量的同時乳酸脫氫酶還能降解乳酸減緩疲勞,阻止蛋白消耗減少血尿素氮的產(chǎn)生[23]。

在肝糖原檢測時,高劑量組(H)肝糖原含量比其他實驗組低,推測原因是小鼠在抗疲勞試驗中運(yùn)動時間過長導(dǎo)致肝損傷[24],經(jīng)過一周的抗疲勞試驗小鼠肝損傷狀態(tài)堆積,處死當(dāng)天沒有充分恢復(fù)狀態(tài)導(dǎo)致肝糖原檢測數(shù)據(jù)低。

綜上所述,繡球菌多糖可以明顯提高小鼠跑臺力竭時間、負(fù)重游泳力竭時間、爬桿力竭時間,增加體內(nèi)糖原儲備,減少體內(nèi)乳酸生成,提高乳酸脫氫酶、肌酸激酶活性,降低體內(nèi)血尿素氮含量,有效提高機(jī)體運(yùn)動耐力,增加機(jī)體抗疲勞能力。