綠球藻多糖抗氧化和復合保鮮液對冷鮮豬肉保鮮效果研究

李 昕, 楊 月, 姜成哲

(1.吉林職業技術學院,吉林 龍井 133400;2.延邊大學農學院,吉林 延吉 133002)

綠球藻為天然堿性供人食用的原材料,對身體健康具有極大益處,此外,綠球藻的作用還十分廣泛,不僅在食品、藥品領域中具有重要作用,在化妝品、保鮮制劑、廢水處理中也具有良好性能[1]。綠球藻多糖在醫療藥物研發方面,如調節免疫、降血糖血脂等已然成為熱點[2-3]。

綠球藻在保鮮方面具有較好的抗氧化功能,有延長保質期的功效[4]。此外,綠球藻還能去除廢水中的重金屬離子,因為綠球藻的細胞膜上存在一種特殊物質,經研究發現,這種特殊的物質就是多糖,蛋白質中的官能團可以與重金屬離子結合,在結合之后,就可以吸附金屬離子,綠球藻細胞膜跟其他質膜具有高度選擇透過性,這種特性從某種程度上決定了綠球藻細胞膜能去除重金屬離子[5]。

殼聚糖(Chitosan,CTS)又稱為殼多糖、脫乙酰基甲殼素、可溶性甲殼質、殼糖胺、幾丁聚糖等,化學名稱為2-氨基-β-1,4-葡聚糖,是由甲殼素(Chitin)經脫乙酰作用的產物,也是目前生物界中發現的唯一的天然堿性多糖[6]。含有游離的氨基和羥基的天然高分子聚合物,具有較好的成膜性能和抑菌效果[7]。化學反應比較強烈,可與多種物質反應,因此具有更多的生物學作用,可在多領域中得到應用。劉利萍等[8]利用殼聚糖降解后的肉樣進行了涂膜,結果表明,降解后的殼聚糖比未降解的殼聚糖具有更好的抑菌作用,熟豬肉6 d仍能保持較好的顏色和香味,而且菌落總數均符合國家規定。Desvit等[9]研究表明,在室溫下,殼聚糖和稻殼煙液混合處理的肉丸對大腸桿菌的抑制范圍為6.49～7.07 mm,對沙門氏菌的抑菌圈為6.52～7.26 mm。

海藻糖是一種還原性雙糖[10],是由2個吡喃型葡萄糖單體通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成的雙糖[11],具有穩定生物大分子的作用,因其優異的穩定性、安全性、低吸濕性被廣泛應用于食品行業。

該研究以綠球藻為原材料,結合殼聚糖和海藻糖作為復合保鮮液對冷鮮豬肉的保鮮效果進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠球藻:由延邊大學生物技術實驗室培養。

三氟乙酸、氯化鈉、氯仿、無水乙醇、甲醇、水楊酸、過氧化氫、鄰苯三酚、過硫酸鉀、DPPH(2,2-聯苯基-1-苦基肼基)、Vc、ABTS[2 ,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]、殼聚糖等均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司;海藻糖,購自青島東孚美倫生物科技有限公司;冷鮮豬肉,購自億品生鮮超市。

1.2 儀器與設備

UV759紫外-可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司);K9840自動凱式定氮儀(濟南海能儀器股份有限公司);HCB-1300V潔凈工作臺(青島海爾特種電器有限公司);SHA-B恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司);MLS-3780高壓蒸氣滅菌鍋(日本三洋電機株式會社);PHS-25數顯pH計(上海儀電儀器股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 綠球藻多糖的制備

準確稱取一定量的綠球藻粉→加適量的去離子水→熱水浸提→離心(3 500 r/min,15 min)→取上清→離心(3 500 r/min,15 min)→取上清用旋轉蒸發儀70 ℃下濃縮至原體積的 1/3→按3∶1體積比加入氯仿-正丁醇溶液(4∶1,體積比),沉淀蛋白2次→按體積比1:3加入85%乙醇醇沉→4 ℃過夜→離心(3 500 r/min,15 min)→沉淀冷凍干燥→綠球藻多糖[12]。

1.3.2 綠球藻多糖含量的測定

1.3.2.1 葡萄糖標準曲線

準確稱取0.1 g葡萄糖于100 mL燒杯中,將標準葡萄糖工作液加入水中,定容到1 000 mL,分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL,將其置于20 mL具塞式玻璃試管中,各以蒸餾水補至1 mL。然后向試液中加入1 mL 5%苯酚溶液,然后快速加入濃硫酸5 mL(沿試管壁緩緩加入,以防混合液濺出),蓋好蓋子上下反復搖勻冷卻10 min,然后將試管放置于30 ℃水浴顯色20 min后,于490 nm測吸光度,采用蒸餾水作為空白對照,以葡萄糖為橫坐標,以吸光度為縱坐標,建立了一條標準曲線[13]。回歸方程分析如圖1所示為標準曲線,y=1.024 4x+0.020 7,R2= 0.999 1。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.2.2 多糖提取率

采用1.3.2的方法,對所提取的綠球藻多糖的吸光值進行測定。利用吳憲玲等[14]的公式:

式中,C為樣液中的多糖濃度,mg/g;N為樣液稀釋倍數;V為提取液的總體積,mL;M為綠球藻多糖的質量,mg。

1.3.3 抗氧化性試驗

1.3.3.1 綠球藻多糖DPPH清除能力測定

用Nattinee等[15]方法對綠球藻多糖DPPH清除能力進行研究。將2 mmol/L DPPH-乙醇溶液移入100 mL棕色量瓶中等待備用,避光保存(0～4 ℃),分別精密量取不同質量濃度(1,5,10,15,20 mg/mL)的樣液以及空白樣液2 mL于具塞管中,分別接入2 mL 2 mmol/L DPPH-乙醇溶液,充分混勻后放置在黑暗環境中避光,反應時間為30 min,在517 nm波長下對其吸光度值進行檢測,同濃度Vc做對照,每組試驗測量重復3次。按照下列公式計算:

清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100,

式中,A1為綠球藻多糖樣品的吸光度值;A2無水乙醇代替DPPH溶液檢測吸光度值為;A0為無水乙醇代替綠球藻多糖溶液檢測吸光度值。

1.3.3.2 綠球藻多糖還原能力測定

參照黃仁術等[16]方法對綠球藻多糖的還原能力進行測定。將2.5 mL不同質量濃度(1,5,10,15,20 mg/mL)的樣液分別與2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值6.6)及2.5 mL鐵氰化鉀(1%)混勻,將混合物在50 ℃水浴中靜止20 min,然后加入2.5 mLTCA(10%)終止反應,3 000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL無水乙醇和0.5 mL FeCl3(0.1%),混勻后靜置10 min,在700 nm處測定吸光度,同濃度Vc做對照,每組實驗測量重復3次。按照下列公式計算:

還原力=A1-A2,

式中,A1為綠球藻多糖樣品的吸光度值;A2為去離子水代替樣品的混合液作為參比溶液的吸光度值。

1.3.3.3 綠球藻多糖羥自由基清除能力測定

參照劉宇琪等[17]水楊酸法進行綠球藻多糖的羥基自由基清除能力的測定。在10 mL試管中依次加入1 mL不同質量濃度(1,5,10,15,20 mg/mL)的樣液,加入6 mmol/L硫酸亞鐵 2 mL,6 mmol/L水楊酸2 mL,2 mL濃度為4.4 mmol/L的過氧化氫溶液,2 mL過氧化氫為起始反應,在510 nm處對吸收度進行測定,用去離子水取代空白組。同濃度Vc做對照,重復3次。按照下列公式計算:

清除率/%=[(A0-A1)/A0]×100,

式中,A0為空白組吸光度值;A1為綠球藻多糖樣品吸光度值。

1.3.3.4 綠球藻多糖超氧陰離子自由基清除能力測定

參照華寧燁等[18]鄰苯三酚自氧化法測定綠球藻多糖清除自由基的能力,在10 mL試管中加入500 μL不同質量濃度(0.2,0.4,0.6,0.8,1 mg/mL)的樣液,依次加入1 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液,pH值為8.3。加入濃度為25 mmol/L鄰苯三酚100 μL充分混勻后,在20 ℃水浴條件下放置時間為6 min(試管需加塞),隨后立即用0.5 mL濃鹽酸終止反應。在420 nm波長下對其吸光度進行檢測,用去離子水取代空白組,用磷酸緩沖劑替代試樣,以同等濃度Vc作為對照,每個試驗測量3次,按照下列公式計算:

清除率/%=[1-(A0-A1)/A2]×100,

式中,A0為綠球藻多糖樣品吸光度值;A1為磷酸緩沖溶液替代樣液吸光值;A2為去離子水替代綠球藻多糖的吸光度值。

1.3.3.5 綠球藻多糖ABTS自由基清除能力測定

參照駱娟等[19]等的方法測定ABTS自由基清除率。用去離子水配制ABTS溶液(ABTS 7 mmol/L,10 mL)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L,10 mL)混合,在室溫條件下避光16 h后制成ABTS自由基溶液,使混合液在734 nm處吸光度為(0.7±0.03),備用(使用80%乙醇稀釋大概31倍得到)。配制不同質量濃度(0.2,0.4,0.6,0.8,1 mg/mL)的樣液1 mL,再用ABTS自由基溶液3.9 mL與樣液混勻,進行避光反應10 min,在734 nm下測量吸收光度值。用1 mL去離子水替代空白,用相同濃度的Vc作為對照組,每個試驗組重復測量3次。根據以下公式來計算:

清除率/%=(A0-A1)/A0]×100,

式中,A0為空白組吸光值;A1為綠球藻多糖樣品吸光度值。

1.3.4 復合保鮮處理

使用3 mL復合保鮮劑[20](前期通過單一保鮮液單因素試驗及響應面試驗最終確定配方比例為:綠球藻多糖1.50%、殼聚糖1.10%、海藻糖0.95%),用無菌一次性手套將試液涂布均勻,11.5 cm×7.5 cm×4.5 cm的透明一次性保鮮盒內,標注,置于4 ℃冰箱內冷藏。

1.3.5 指標測定

1.3.5.1 菌落總數的測定

按照《食品微生物學檢驗菌落總數測定》(GB4789.2-2016)對其進行了檢測。無菌操作稱取樣品5 g,用滅菌剪刀剪碎,放入裝有90 mL 0.85%無菌生理鹽水錐形瓶中,封口后搖床振搖3 min,然后取1 mL上清液,進行10倍遞增稀釋,選擇合適的稀釋度,傾注平板,倒入PCA培養基,在37 ℃恒溫培養箱中恒溫培養48 h后計數。

1.3.5.2 揮發性鹽基氮值(TVB-N)的測定

采用半微量定氮法,按 GB5009.228-2016 《食品中揮發性鹽基氮的測定》進行研究。取5 g肉切碎攪勻,置于錐形瓶中,加100 mL水,不停震搖,浸漬30 min后過濾,濾液置冰箱備用。預先將盛有10 mL 2%硼酸吸收液并加有5～6滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端,并使其下端插入錐形瓶內吸收液的液面下,吸取5.0 mL上述樣品濾液于蒸餾器反應室內,加5 mL 1%MgO混懸液,迅速蓋塞,并加水以防漏氣,通入蒸氣,待蒸氣充滿蒸餾器內時關閉蒸氣出口管,由冷凝管出現第1滴冷凝水開始計時,蒸餾5 min即停止,吸收液用0.01 mol/L鹽酸標準溶液濃度來進行滴定,終點至藍紫色。同時做試劑空白試驗。

1.3.5.3 pH值的測定

采用《食品pH的測定》(GB5009.237-2016)對其進行了檢測。用pH值直測儀測定pH值,在測定前首先需要對設備進行校準,然后把其插入到肉樣中進行pH值檢測,需要讓探頭插入肌肉中,深度為2 cm左右,待數值穩定之后,對顯示的數值進行讀取。平行3次減少試驗誤差。

1.3.5.4 汁液流失率的測定

參照張俐勤等[21]方法,準確稱量樣品貯藏前質量M1,每次對肉樣進行稱量的時候,將汁液吸干,貯藏后質量為M2。

汁液流失率/%=(M1-M2)/M1×100.

1.3.5.5 感官評價

抽取10名感官評定人員,讓其評價肉湯、肉樣的色澤等。參照楊春婷等[22]的感官評定方法,采用0～4 ℃冷鮮豬肉進行感官評定。評價的標準見表1,8～10分較好,6～8分中等,4～6分為差,低于2分為已經變質。

表1 感官評價表

1.4 數據分析

采用SPSS20.0對數據的顯著性進行分析(P<0.05),采用Origin 2018繪作制圖。每組試驗重復3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 綠球藻多糖對抗氧化指標的影響

2.1.1 綠球藻多糖對DPPH清除能力的影響

由圖2可以看出,隨著質量濃度的提高2個試驗組的DPPH清除率也跟著提高,濃度為1 mg/mL時, 綠球藻多糖和Vc的DPPH自由基清除率分別為17.20%和100%,當濃度為15 mg/mL時,綠球藻多糖達到56.93%,當濃度為20 mg/mL時,綠球藻多糖的DPPH自由基清除率達到98.69%。

圖2 綠球藻多糖DPPH自由基清除率

2.1.2 綠球藻多糖對還原能力的影響

由圖3可知,綠球藻多糖的還原能力隨濃度的增大而增大。

圖3 綠球藻多糖還原能力

Vc對照組的還原力一直優于綠球藻多糖組。當濃度為1 mg/mL時, 綠球藻多糖還原力為0.07,Vc還原能力為0.72,當濃度達到20 mg/mL時,綠球藻多糖的還原能力達到0.64,對照的還原能力達到1.17,雖然沒有Vc組的還原能力強,但結果表明,綠球藻多糖組具有一定的抗氧化能力。

2.1.3 綠球藻多糖對羥自由基清除率的影響

由圖4可知,隨著質量濃度的上升,2個試驗組的羥自由基清除率都呈現上升的趨勢,當濃度達到1 mg/mL時,試驗組與Vc對照組清除率差別不大,綠球藻多糖清除率為21.80%,Vc清除率為22.54%,但當濃度達到5 mg/mL時,試驗組的清除率明顯高于對照組,羥基自由基清除率分別為64.99%和 29.25%,這說明綠球藻多糖羥自由基清除效果非常顯著。

圖4 綠球藻多糖羥自由基清除率

2.1.4 綠球藻多糖對超氧陰離子自由基清除能力的影響

由圖5可知,當綠球藻多糖和Vc對照組濃度為1 mg/mL時,2組都達到最高清除率,分別是90.15%和100%,從試驗結果可以看出,實驗室自養綠球藻多糖的超氧陰離子的清除效果較好。

圖5 綠球藻多糖超氧陰離子自由基清除率

2.1.5 綠球藻多糖對ABTS自由基清除能力的影響

由圖6可知,隨著濃度的升高,綠球藻多糖與對照組Vc的清除能力都在增強,但很明顯綠球藻多糖組效果要顯著低于Vc組(P<0.05)。當濃度達到1 mg/mL時,綠球藻多糖與陽性對照組ABTS 自由基清除率分別可達80.10%和100.00%。盡管其清除效果遠不及 Vc,但仍顯示出綠球藻多糖抗氧化性。

圖6 綠球藻多糖ABTS自由基清除率

2.2 復合保鮮液對保鮮效果的影響

2.2.1 復合保鮮液對冷鮮肉菌落總數的影響

由圖7可知,冷鮮肉菌落總數隨貯存時間的延長顯著性增加(P<0.05),冷鮮肉0 d時菌落總數為(2.50±0.17) CFU/g,第6天對照組的菌落總數為(6.12±0.11) CFU/g,此時冷鮮肉已腐敗變質,而綠球藻多糖處理組和復合處理組的菌落總數分別為(5.24±0.07) CFU/g和(5.01±0.12) CFU/g,顯著低于對照組(P<0.05),且在冷鮮肉國標范圍內。

圖7 復合保鮮液對冷鮮肉菌落總數的影響

但第10天復合保鮮處理組的菌落總數仍在鮮肉范圍內,對照組、綠球藻多糖處理組和復合處理組的菌落總數分別為(7.50±0.04)、(5.69±0.05)和(5.34±0.04)CFU/g,表明復合保鮮劑比單獨使用綠球藻多糖具有更好的保鮮作用,復合處理組與單一試驗組有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.2 復合保鮮液對冷鮮肉TVB-N值的影響

由圖8可知,相對于對照組而言,綠球藻多糖和復合處理組的TVB-N值逐漸升高,對照組0 d時TVB-N值為(5.60±0.06) mg/100 g,第6天為(15.08±0.05) mg/100 g,超過國家標準,第10天對照組、綠球藻多糖處理組和復合處理組的TVB-N值分別為(23.90±0.13) mg/100 g、(13.20±0.11) mg/100 g和(10.50±0.07) mg/100 g,對照組超過國家標準,而復合涂膜處理的冷鮮肉仍然在新鮮肉類范圍之內,復合處理組的TVB-N值顯著低于其他組(P<0.05),說明復合保鮮劑的保鮮效果顯著優于綠球藻多糖試驗組。

圖8 復合保鮮液對冷鮮肉TVB-N值的影響

2.2.3 復合保鮮液對冷鮮肉pH值的影響

由圖9可知,對照組的 pH值在0～10 d隨冷藏時間的延長,從0 d的(5.50±0.54)上升至第10天的(6.58±0.11),相對于對照組而言,綠球藻多糖處理組和復合處理組的pH值增加緩慢,說明綠球藻多糖和復合處理組在一定程度上抑制冷鮮肉的 pH值升高。

圖9 復合保鮮液對冷鮮肉pH值的影響

2.2.4 復合保鮮液對冷鮮肉汁液損失率值的影響

由圖10可知,冷鮮肉在2～6 d 的汁液流失率增長較慢,6～10 d 時,汁液損失率明顯低對照組(P<0.05), 6～8 d對照組的汁液流失率有顯著性提高。綠球藻多糖和復合處理組的汁液流失率顯著低于對照組(P<0.05),第10天對照組、綠球藻多糖和復合處理組的汁液流失率值分別為(10.60±0.08)%、(7.91±0.02)%和(7.71±0.10)%。

圖10 復合保鮮液對冷鮮肉汁液流失率的影響

2.2.5 復合保鮮液對冷鮮肉感官評價的影響

此感官評價參照劉渝港等[23]的方法進行,感官評價人員在色澤、氣味、組織形態、黏性等方面對各試驗組進行評分(表2)。

表2 感官評價分數結果

由表2可知,復合組各方面結果為最優組,試驗過程中,2 d時所有組整體差異性不顯著,綠球藻多糖處理組在8 d時開始出現和對照組6 d時一樣的情況,開始出現異味,黏性增加且生肉表面呈現暗紅色,肉湯較渾濁,雜質多,空白組在8 d時明顯異味,組織黏性大,肉湯渾濁,雜質多,10 d實驗結束,復合處理組與其他單一試驗組有顯著性差異(P<0.05),說明復合處理組感官綜合評價最好。

3 討論與結論

綠球藻多糖具有較好的抗氧化活性,在20 mg/mL濃度下羥自由基清除能力達到98.00%;還原能力為0.64;DPPH自由基清除率達到98.69%,孫建瑞等[24]在60 mg/mL條件下,小球藻多糖清除率接近43.00%,綠球藻多糖對DPPH的清除能力強于小球藻多糖。當濃度為1 mg/mL時,超氧陰離子自由基清除率達到90.15%;在相同最高濃度1 mg/mL試驗下,李旭東[25]綠球藻多糖和史瑞琴等[26]小球藻多糖口服液的超氧陰離子的清除分別是42.00%和20.00%,在相同試樣濃度下,該試驗研究的對超氧陰離子的清除能力優于上述2位試驗結果50.00%左右,說明實驗室自養綠球藻多糖的清除率與同類微藻類超氧陰離子的清除能力高很多,效果較好。當濃度為1 mg/mL時,ABTS自由基清除率達到80.10%,這與孫佳玉等[27]研究的金線蓮不同植物材料提取物抗氧化能力結果一致,當組培苗提取物濃度達到4 mg/mL時,ABTS清除率為59.09%,說明綠球藻多糖ABTS自由基清除效果較好。

孫彥峰等[28]將綠球藻多糖與殼聚糖混合,制成了一種可食用的生物活性薄膜,結果表明,綠球藻多糖具有良好的自然活性成分,可以在一定程度上與殼聚糖結合,從而形成一種具有良好結構的包裝薄膜。可見綠球藻多糖可望成為天然的抗氧化劑,試驗結果說明,經復合保鮮液處理過的冷鮮肉第10天時菌落總數為(5.34±0.04)CFU/g,TVB-N值為(10.50±0.07) mg/100 g,pH值為(6.10±0.06),汁液損失率為(7.71±0.10)%,感官評分值(除第2天外)均顯著低于對照組 (P<0.05),仍處于鮮肉標準范圍,可將冷鮮肉的貨架期延長至第10天。