SerpinB1a蛋白表達與小鼠酒精性脂肪肝發生及白藜蘆醇干預作用的相關性研究*

韓 敏,易 旭

(1.貴州中醫藥大學基礎醫學院,貴陽 550025;2．貴州中醫藥大學第二附屬醫院臨床醫學實驗室,貴陽 550003)

研究表明,長期慢性酒精攝入能夠通過異常酒精代謝導致的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)百分比增加、氧化應激誘導、脂質代謝紊亂、抑制自噬等機制誘發肝細胞的脂肪變性[1],從而形成酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)[2]。自噬作為各種生理和疾病條件下細胞適應和生存的一種重要機制,在維持細胞穩定性中有著重要作用[3]。研究發現,慢性酒精攝入能夠激活FK-506結合蛋白(FKBP)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORc1)和抑制腺苷酸激活蛋白激酶表達,通過抑制下游的Unc-51樣激酶1(ULK1)復合體形成導致自噬的抑制,出現肝細胞中脂質的積累、線粒體穩態失調和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLIP3)炎癥小體活化增多等從而促進脂肪肝的形成[4-5]。因此,調節自噬是AFLD的一種潛在治療策略,這一認識已在白藜蘆醇通過增加自噬體數量,上調微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin1表達,下調p62蛋白表達發揮抗AFLD的治療作用中得到驗證[6]。研究發現,酒精暴露還可以抑制自噬激活的另一重要調節分子叉頭框蛋白O1(FOXO1)的表達,導致固醇調節元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)與脂肪酸合成酶表達水平上調,從而增加脂質生成和誘導肝細胞壞死[7-9]。但酒精如何介導FOXO1表達抑制仍不清楚。LIANG等[10]發現,主要在肝臟合成的絲氨酸蛋白酶抑制劑B1a(SerpinB1a)表達抑制會下調FOXO1表達水平,減弱FOXO1的抗氧化應激作用,從而加重糖尿病性腎病中的氧化應激反應。這提示SerpinB1a對FOXO1表達水平的正向調控作用,但SerpinB1a是否參與AFLD的發生尚缺少文獻報道。已知磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3(pSTAT3)可以通過對Bcl-2家族成員、自噬相關基因BECN1、磷脂酰肌醇3激酶C3(PIK3C3)等與自噬相關基因的轉錄調節參與自噬的抑制或活化[11]。運用乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因敲除小鼠,發現激活STAT3可以通過減弱SREBP-1c基因轉錄、抑制脂肪酸合成和影響脂肪肝發展來減輕乙醇攝入引起的脂肪肝[12]。此外,pSTAT3在AFLD中通過上調自噬相關基因5(ATG5)的表達促進自噬以發揮保護作用[13]。XU等[14]通過慢病毒轉染抑制豬胰腺細胞SerpinB1a蛋白表達,引起pSTAT3表達水平下調,相反,過表達SerpinB1a蛋白則可以通過上調pSTAT3表達來調節細胞周期以促進豬胰腺細胞增殖,提示了SerpinB1a與pSTAT3存在正調控關系。但尚未見肝臟相關疾病中有關SerpinB1a與pSTAT3調控關系的研究報道。

基于AFLD病理階段存在FOXO1和pSTAT3介導的肝臟自噬抑制作用及其分別與SerpinB1a的調控關系的研究認識,設想SerpinB1a在肝組織表達水平的變化可能與AFLD的發生有關。因此,本文采用4D非標記定量蛋白質組學技術鑒定、分析了SerpinB1a蛋白在AFLD小鼠肝組織中的表達水平及其在白藜蘆醇抗AFLD干預機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

選取雄性無特殊病原體(SPF)級C57BL/6J小鼠9只[北京唯尚立德,SCXK(京)2016-0009],體重20～24 g,在有適宜溫度、濕度、光照的獨立通風籠具(IVC)系統的動物房內飼養。將小鼠隨機分為3組:正常對照組(C組)、模型組(M組)、白藜蘆醇干預組(R組),每組各3只。

1.1.2主要試劑

95%乙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);胰酶[普洛麥格(北京)生物技術有限公司];丙酮(浙江漢諾化工科技有限公司);蛋白酶抑制劑(美國Merck Millipore公司);碘乙酰胺、尿素、煙酰胺、二硫蘇糖醇、三氯乙酸及四乙基溴化銨(美國Sigma公司);甲酸(美國Fluka公司);去乙?；敢种苿?美國MedChemExpress公司);乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);超純水(美國Fisher Chemical公司)等。

1.2 方法

1.2.1AFLD小鼠模型建立及白藜蘆醇干預

參考文獻[15]方法進行AFLD模型制備,即使用江蘇南通特洛菲標準型Lieber-DeCarli乙醇液體、對照液體飼料適應性喂養5 d后,自由進食10 d乙醇液體飼料,第16天灌胃給予1次95%乙醇。經鑒定模型制備成功后,按1次/d、400 mg/次灌胃給予白藜蘆醇溶液(美國Sigma公司,使用滅菌的30% Kolliphor HS15溶液配制),9 d后收集肝組織標本,置于-80 ℃超低溫冰箱中以備蛋白質組學檢測用。

1.2.2SerpinB1a蛋白的4D非標記定量蛋白質組學分析

1.2.2.1鑒定思路

構建UniProt數據庫來源的小鼠肝組織標本特異性蛋白數據庫,進行標本總蛋白提取和胰酶酶解后的蛋白肽段制備,經基于高效液相色譜-質譜聯用的4D非標記定量蛋白質組學技術獲得并分析標本中肽段的質量與信號強度,以及肽段碎裂后碎片離子的質量和信號強度。利用Maxquant軟件(v1.6.15.0)進行二級質譜數據的檢索,通過算法打分過濾后獲得正確匹配的理論肽段序列。

1.2.2.2肝組織中總蛋白提取、胰酶消化

稱取適量小鼠肝組織樣品于液氮中充分研磨成粉狀并轉移至5 mL的離心管。然后,加入4倍體積的組織裂解液(含50 mmol/L煙酰胺,3 μmol/L去乙?；敢种苿?1%蛋白酶抑制劑及8 mol尿素)超聲下裂解。在4 ℃下,12 000×g離心10 min,去除剩余碎片,收集上清液,采用BCA法測定蛋白質水平。在胰蛋白酶消化過程中,首先向離心管中加入適量標準蛋白,再加入裂解液以調整體積至一致,緩慢向其中加入20%的三氯乙酸,利用渦旋混勻儀振蕩、混勻,4 ℃靜置2 h以充分沉淀。4 500×g離心5 min后,用預冷的丙酮3次洗滌所得蛋白沉淀,晾干后加入200 mmol/L的四乙基溴化銨并于超聲儀中充分打散,經酶底比1∶50(m/m)的胰酶消化過夜。先后加入5 mmol/L二硫蘇糖醇56 ℃還原30 min、11 mmol/L碘乙酰胺室溫暗孵育15 min。

1.2.2.3液相色譜-質譜聯用分析

用NanoElute超高效液相系統分離溶解于液相色譜流動相A相(含2%乙腈和0.1%甲酸)中的樣品蛋白肽段。配制含0.1%甲酸和100%乙腈溶液的流動相B,以0～1 min,2%～5% B;>1～76 min,>5%～27% B;>76～82 min,>27%～35% B;>82～86 min,>35%～85% B梯度,300 nL/min流速洗脫多肽。分離后的多肽被注入Capillary離子源(電壓1.75 kV)中進行電離和隨后的飛行時間(time-of-flight,TOF)質譜timsTOF Pro分析。采用高分辨的TOF質譜檢測和分析肽段母離子及其二級碎片。參考文獻[16]方法進行二級質譜掃描和數據收集。

1.2.2.4定量分析

根據質譜數據的搜庫分析結果給出的每個肽段在不同樣品中的信號強度信息計算蛋白的相對定量。即首先將信號強度值(I)通過中心化變化后,按公式R_{ij}=I_{ij}/Mean(I_j)得到肽段在不同樣品中的相對定量值(R),i表示樣品,j表示肽段;然后采用中位數歸一化方法對得到的肽段相對定量值進行校正(NR)以消除不同樣品在質譜檢測中上樣量的系統誤差,計算公式:NR_{ij}=R_{ij}/Median(R_i);最后采用蛋白對應特異性肽段相對定量值的中值表示蛋白的相對定量值。計算公式:R_{ik}=Median(NR_{ij},j/in k),k表示蛋白,j表示蛋白所屬的特異性肽段。分別采用Person相關性、主成分分析和相對標準差3種統計分析方法評估蛋白定量重復性。

1.2.2.5SerpinB1a蛋白基因本體論(GO)功能富集分析

采用UniProt-GOA數據庫的GO分類分析方法,從分子功能、細胞組成和生物進程等角度對SerpinB1a蛋白的生物學作用進行注釋,并結合當前AFLD發生機制相關國內外研究文獻推測涉及AFLD發生、發展的內容。

1.2.3SerpinB1a蛋白表達的驗證

1.2.3.1總體思路

采用基于質譜技術的靶向蛋白質組定量分析方法。將上述蛋白組學獲得的含SerpinB1a蛋白的肽段分別進行EASY-nLC 1000超高效液相系統分離和電離后的Q-ExactiveTMPlus質譜分析,經Max-Quant軟件(v1.6.15.0)數據庫搜索后進行數據處理。

1.2.3.2液相色譜-質譜聯用分析

SerpinB1a蛋白肽段來自上述蛋白組學剩余肽段,經液相色譜流動相A相(含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解后,使用EASY-nLC 1000超高效液相系統進行分離。流動相B為含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設置:0～16 min,7%～25% B;>16～22 min,>25%～35% B;>22～26 min,>35%～80% B;>26～30 min,>80% B,流速維持在500 nL/min。肽段經由超高效液相系統分離后被注入納米噴霧電離(NSI)離子源中進行電離,然后用Q ExactiveTMPlus質譜進行分析。離子源電壓設置為2.1 kV,肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進行檢測和分析。一級質譜掃描范圍設置為360～1 020 m/z,掃描分辨率設置為70 000;二級質譜Orbitrap掃描分辨率設置為17 500。數據采集模式使用數據非依賴型掃描(DIA)程序,高能碰撞離解(HCD)碰撞池的碎裂能量設置為27。一級質譜自動增益控制(AGC)設置為3E6,最大離子注入時間(maximum IT)設置為50 ms;二級質譜AGC設置為1E5,maximum IT設置為250 ms,隔離窗口設置為1.6 m/z。

1.2.3.3數據處理

肽段參數設置:蛋白酶為胰蛋白酶[KR/P],K、R、P分別代表賴氨酸、精氨酸、脯氨酸,最大漏切位點數為0,肽段長度為7～25個氨基酸殘基,設置半胱氨酸烷基化為固定修飾。Transition參數設置:母離子電荷為2,3;子離子電荷為1;離子類型為b,y。碎片離子選擇從第3個開始至最后1個,并設置離子匹配的質量誤差容忍度為0.02 Da。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 SerpinB1a蛋白的4D非標記定量蛋白質組學鑒定與定量結果

經課題組前期造模成功后,在蛋白組學中各實驗組肝組織中均鑒定到SerpinB1a蛋白,蛋白質登記號:Q9D154,肽段:FQSLNAEVSK。以3組中SerpinB1a蛋白質重復測量平均值比值作為差異倍數,當P≤0.05且差異倍數≥2或≤0.5時被認為具有明顯差異。與C組(2.18±0.51)比較,M組SerpinB1a蛋白相對表達水平(0.18±0.09)明顯下降(P=0.002),下調表達0.08倍;與M組比較,R組SerpinB1a蛋白相對表達水平(1.08±0.07)明顯升高(P=0.004),上調表達6.00倍。

2.2 SerpinB1a蛋白的GO富集分析結果

經GO富集分析,顯示SerpinB1a蛋白共涉及8個分子功能、20個細胞組成和59個生物進程,進一步推測其中的2個分子功能、3個細胞組成和12個生物進程涉及AFLD的發生、發展,見表1。

表1 SerpinB1a蛋白的GO富集分析

2.3 SerpinB1a蛋白表達的驗證

利用以質譜技術為基礎的靶向蛋白質組定量技術對SerpinB1a蛋白表達水平進行驗證。采用峰面積進行定量,呈現的7種顏色條帶分別對應肽段在質譜儀中裂解后的7種特異性氨基酸序列,見圖1。結果顯示:與C組比較,M組SerpinB1a蛋白表達水平下調0.21倍,與上述4D非標記定量蛋白質組學的定量結果一致。

C1～C3:C組;M1～M3:M組。

3 討 論

近年來,日益發展的蛋白質組學技術在基因組學等其他“組學”技術基礎上進一步表明了生物個體蛋白的身份、識別蛋白質的分子構成,為探究疾病的發病機制、尋找分子標志物和了解藥物作用靶點等提供了重要線索[17-18]。運用蛋白組學方法在非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型和相應的臨床患者肝臟中均發現自噬相關基因3(ATG3)是與脂肪變性發生有關的新分子,其表達與NAFLD脂肪變性分級和活動評分呈正相關[19]。CARLSSON等[20]運用蛋白質組學方法發現,生長分化因子15是糖尿病腎病和心血管事件發生的潛在生物標志物,為糖尿病腎病和心血管疾病的機制研究提供了新的見解。DING等[21]運用等壓標記定量蛋白質組學技術,發現超氧化物歧化酶2(SOD2)在唾液中可能作為肝細胞癌的潛在生物標記物,提供了一種無創、廉價的唾液檢測方法來檢測肝細胞癌。本研究借助蛋白質組學技術的優勢,采用4D非標記定量蛋白質組學技術檢測和分析了乙醇喂養AFLD小鼠和經白藜蘆醇干預后的小鼠肝組織SerpinB1a蛋白表達水平變化。結果顯示,M組小鼠肝組織SerpinB1a蛋白表達水平較C組下調0.08倍,經白藜蘆醇干預后上調6.00倍。表明慢性酒精攝入可以引起肝組織SerpinB1a蛋白表達水平下降,提示該蛋白可能同時參與了AFLD的發生和白藜蘆醇的AFLD保護作用。目前,尚未發現SerpinB1a蛋白與酒精性肝損傷及白藜蘆醇保護作用相關文獻報道,值得進一步關注和探討。

白藜蘆醇是一種存在于多種植物中的天然多酚,作為沉默信息調節因子1(SIRT1)激動劑[22],具有抗炎、抗缺血、抗氧化、抗癌、心臟保護等調節作用[23]。研究發現,白藜蘆醇可通過促進自噬以減少酒精誘導的肝臟脂肪變性[6],下調缺氧誘導因子和細胞色素P4502E1(CYP2E1)表達,減少活性氧(ROS)等有害物質產生[24],加速巨噬細胞極化以抗凋亡[25],發揮酒精性肝損傷保護作用。但截至目前,其具體的分子干預機制尚不清楚。人類SerpinB1(小鼠SerpinB1a的功能同源物)與多種疾病有關,如2型糖尿病患者血清SerpinB1水平明顯升高與胰島B細胞功能障礙、血糖控制和血脂異常有關[26],SerpinB1通過調控生長因子信號通路促進胰島B細胞增殖以應對胰島素抵抗[27]。MOURAD等[28]檢測了葡聚糖硫酸酯鈉誘導的炎癥性結腸炎模型小鼠的結腸蛋白表達情況,發現SerpinBla表達上調并參與先天免疫反應。運用蛋白組學串聯質譜標簽(TMT)和生物信息學技術發現早期大鼠急性胰腺炎中SerpinB1a低表達,并通過減弱對彈性蛋白酶的抑制發揮抗炎作用[29]。在癌癥領域也顯示,過表達SerpinB1會促進口腔癌細胞在侵襲性口腔鱗狀細胞癌中的轉移[30],相反地,在乳腺癌、肺癌與肝細胞癌等癌組織中SerpinB1表達增強并抑制基質金屬蛋白酶2活性,從而發揮抑癌作用[31-32]。由此可見,SerpinB1a與多種疾病發生或保護作用有關,涉及免疫防御、蛋白水解、抑癌或促進癌細胞擴散等多種反應,在不同疾病中存在正性或負性表達的差異性。本研究發現在慢性酒精攝入后,肝臟SerpinB1a表達水平明顯下調和經白藜蘆醇干預后SerpinB1a表達水平明顯上調,這提示有必要進一步證實其是否真的參與了AFLD發生的保護作用及其機制。

與4D非標定量蛋白質組學檢測結果模式一致,靶向蛋白質組定量技術驗證了SerpinB1a蛋白表達在AFLD小鼠肝組織明顯下調,提示該蛋白在AFLD發生中的保護作用,白藜蘆醇干預后SerpinB1a蛋白表達明顯上調可初步證明這一點。根據前言所述,在研究基于AFLD疾病階段的肝臟自噬抑制作用,以及經FOXO1和pSTAT3介導的酒精攝入引起的肝損傷與SerpinB1a的調控關系基礎上,作者提出了SerpinB1a在酒精誘導的肝損傷保護中可能通過FOXO1-STAT3介導的自噬信號通路發揮作用。已知FOXO1通過正向調控應激誘導蛋白3以抑制mTORc1、增強自噬相關基因(ATGs)的表達,實現自噬誘導的調控[11]。SINGH等[33]在肝細胞中對ATG7基因進行特異性敲除,并檢測了肝組織中甘油三酯水平,以研究自噬是否參與了脂質分解代謝,結果顯示:在抑制自噬后肝臟中甘油三酯積累明顯增多。相反,激活自噬有助于肝細胞中脂質的分解,通過脂吞噬或微脂噬兩種自噬形式,從而減少肝細胞中脂肪變性[34]。除了參與調控自噬和脂質分解代謝的調節,FOXO1還能降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的轉錄活性,減少游離脂肪酸的攝取,并抑制脂肪酸合成酶和乙酰輔酶a羧化酶1的表達,從而抑制脂肪的合成并減少肝臟中甘油三酯的積累[35-36]。此外,FOXO1的表達下調會降低超氧化物歧化酶(SOD)生成,加重氧化應激發生[37]?；赟erpinB1a與FOXO1、PPARγ的關系[10-11,35-36],以及抗氧化應激、自噬誘導在白藜蘆醇抗酒精性肝損傷的研究發現[6,24],作者認為上調SerpinB1a的表達、經FOXO1介導的PPARγ拮抗作用及自噬誘導可能是白藜蘆醇發揮AFLD保護作用的重要機制。此外,作為肝保護信號的信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3),既可以通過上調Bcl-2互作蛋白3的表達誘導自噬[11],進而促進脂肪分解,減少脂肪變性,還可以通過抑制SREBP-1c的表達來抑制脂肪合成[38]。因此,SerpinB1a的肝臟保護作用也可能是通過激活肝細胞中的STAT3,進一步激活自噬以加快脂肪分解,并抑制SREBP-1c表達以減少脂肪生成來發揮的。

綜上所述,本文探討了SerpinB1a表達水平與AFLD發生的關系,提出了SerpinB1a可能作為FOXO1、STAT3介導的自噬誘導上游調控因子,其表達水平的變化參與了AFLD的形成及白藜蘆醇的抗AFLD作用,但還需要進一步驗證。總之,本文為完善AFLD發生的分子機制及探討白藜蘆醇的AFLD保護機制提供了科學的實驗室依據。