綠原酸灌胃對博萊霉素誘導小鼠肺纖維化的改善作用及其機制

王倩，劉宇，王榮麗

西南醫科大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，四川瀘州 646000

特發性肺纖維化（IPF）是一種病因不明、局限于肺部的慢性進行性纖維化性的間質性肺炎，其組織學和（或）胸部高分辨率CT（HRCT）常特征性表現為普通型間質性肺炎（UIP）［1］。IPF 好發于老年人，確診后患者中位生存時間2～5 年，5 年生存率20%～25%［2］。目前IPF 的病因及發病機制仍不明確，目前FDA 僅批準尼達尼布（nintedanib）和吡非尼酮（pirfenidone）可用于治療IPF，但治療效果較差［3］。轉化生長因子-β（TGF-β）是最有效的促纖維化細胞因子，在誘導肺纖維化中起關鍵作用，其中TGF-β1是其主要的形式。TGF-β 可促進肺成纖維細胞的增殖，促使肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，導致Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（CollagenⅢ）等細胞外基質（ECM）過度沉積，最終形成纖維化病灶［4］。上皮-間充質轉化（EMT）發生過程中，上皮細胞失去極性，E-鈣粘蛋白（E-Cadherin）、角蛋白等上皮細胞表型丟失或表達下調，波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等間質細胞標記物表達上調，其中TGF-β可通過調控Smad信號通路誘導EMT，促進肺泡上皮細胞向肌成纖維細胞分化，導致細胞外基質積聚［5］。綠原酸（CGA）也被稱為3-咖啡酰奎尼酸（3-CQA）［6］，是一種具有多種生物活性的酚類化合物；廣泛分布在杜仲、金銀花、茵陳、枸杞、咖啡豆、獼猴桃等藥品及食品中；具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝及降糖等作用［7］。CGA可通過抑制NF-κB p65 的磷酸化、降低炎癥反應程度，減輕補體旁路激活誘導的小鼠急性肺損傷［8］；體內外實驗［9］發現，CGA可通過抑制內質網應激來抑制肺纖維化。CGA 是否可通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路，抑制肺組織EMT 過程，發揮抗肺纖維化的作用，目前尚無相關研究。為此，2022年3—6月，我們觀察了CGA 對博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化的改善作用，進一步探討其可能作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑 清潔健康雄性C57BL/6 小鼠60只，6～8 周齡，體質量（20 ± 2）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司［實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010］。小鼠飼養于溫度 22～25 ℃、濕度50%～70%、12 h 晝夜循環的環境內，自主攝入水和食物。實驗所有操作均符合實驗動物福利倫理標準。鹽酸博萊霉素（純度≥98%，溶于生理鹽水）購自北京泰澤嘉業科技發展有限公司；CGA（純度≥98%，溶于超純水）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HE 染色試劑盒、Masson 三色染色液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Collagen Ⅰ、Vimentin、α-SMA、TGF-β1抗體購自北京邁瑞達科技有限公司；Smad2/3 抗體購自成都杰德諾生物科技有限公司；免疫熒光染色試劑盒購自海門碧云天生物技術有限公司。

1.2 動物分組、博萊霉素（BLM）及CGA 給予方法 將60 只小鼠適應性飼養3 天后隨機分為6 組（對照組、模型組、CGA 低劑量組、CGA 中劑量組、CGA 高劑量一組、CGA 高劑量二組），每組各10 只。其中5 組小鼠用博萊霉素誘導肺纖維化［10］（誘導當天記作第1 天）：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉小鼠，固定四肢及頭部，75%酒精消毒頸部，手術剪行正中縱向切口，鈍性分離肌肉、組織直至暴露氣管，經氣管軟骨環間隙行氣管切開，用微量移液器將2 mg/kg 博萊霉素溶液沿氣管切口朝向心端緩慢注入氣管內；對照組小鼠相同操作后注入等體積生理鹽水。各組小鼠注入液體后立即將鼠板直立旋轉抖動，使博萊霉素/生理鹽水在肺內均勻分布，縫合肌肉、皮膚后將各組小鼠置于鼠籠中自然蘇醒。第1 天小鼠自然蘇醒后，CGA 高劑量二組小鼠予CGA80 mg/kg 灌胃，1 次/天，連續灌胃14 d。第8 天起，CGA 低劑量組、CGA 中劑量組、CGA 高劑量一組分別予CGA20、40、80 mg/kg 灌胃，1 次/天，連續灌胃14 d。第8 天起，對照組及模型組予等體積超純水連續灌胃，1次/天，連續灌胃14天。

1.3 各組小鼠左肺纖維化程度觀察 觀察并記錄各組小鼠存活數量。飼養第21 天后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠、頸椎脫臼法處死后稱重，開胸分離雙肺，用濾紙吸干雙肺表面的液體后稱取濕重，按公式：肺系數（%）=肺濕重（mg）/小鼠體質量（g）×100%計算肺系數。將各組小鼠左肺置于10%多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋后對左肺組織行5 μm連續切片。按照HE 染色試劑盒操作說明書步驟進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察并記錄各組小鼠肺組織形態學改變。取各組左肺組織切片，按照Masson 三色染色試劑盒操作說明書步驟進行Masson 染色，于光學顯微鏡下觀察并記錄小鼠左肺組織中膠原纖維沉積情況。依照Ashcroft 評分［11］標準對各組小鼠左肺組織纖維化程度進行定量分析：正常肺組織計0 分，肺泡或細支氣管壁纖維輕度增厚計1 分，肺泡壁中度增厚、肺組織結構無明顯破壞計3分，肺組織改變介于1、3分之間計2分，肺纖維化進一步加重、肺組織結構明顯破壞、并且有纖維帶或小纖維團塊形成計5 分，肺組織改變介于3、5 分之間計4 分，肺組織結構嚴重破壞、大面積纖維灶形成、可有“蜂窩肺”形成計7 分，肺組織改變介于5、7 分之間計6分，整個視野肺組織完全纖維化閉塞壞死計8分。

1.4 各組小鼠肺組織TGF-β1/Smads、EMT、脂質過氧化相關指標檢測

1.4.1 各組小鼠肺組織EMT 過程中間質細胞標記物α-SMA 蛋白檢測 采用免疫熒光法。按照免疫熒光染色試劑盒說明書操作步驟進行，然后在熒光顯微鏡下觀察、拍照，肺組織中α-SMA 蛋白呈橙紅色熒光；每張切片隨機選擇3 個視野，用Fiji（Fiji is just ImageJ）軟件對蛋白陽染面積的熒光強度進行定量分析，以蛋白陽染面積熒光強度代表α-SMA 蛋白的相對表達量。重復測算3次，取平均值。

1.4.2 各組小鼠左肺組織細胞外基質蛋白CollagenⅠ、EMT過程中間質細胞標記物Vimentin及TGF-β1/Smads 信號通路相關蛋白檢測 采用免疫組化法。按照免疫組化試劑盒說明書操作步驟嚴格進行。顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇3個視野，用Fiji（Fiji is just ImageJ）軟件測算蛋白陽染面積的平均光密度值（MOD），肺組織中細胞核呈藍色，Collagen I、Vimentin、TGF-β1、Smad2/3 蛋白陽性表達為棕色或棕黃色顆粒。以MOD 值代表Collagen Ⅰ、Vimentin、TGF-β1、Smad2/3 蛋白的相對表達量。重復測算3次，取平均值。

1.4.3 各組小鼠右肺組織丙二醛（MDA）檢測 采用硫代巴比妥酸法（TBA法）。取小鼠右肺組織按照MDA 試劑盒說明書操作步驟，制備成10%肺組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液。用酶標儀在波長532 nm 處測定每個樣本的吸光度（OD 值），使用已知丙二醛含量的樣本生成標準曲線，計算各組小鼠右肺組織MDA 含量（nmoL/mgprot）。MDA 含量越高，說明肺組織脂質過氧化程度越明顯。

1.4.4 各組小鼠右肺組織EMT過程中上皮細胞標記物E-cadherin mRNA、間質細胞標志物α-SMA mRNA 檢測 采用Real-time qPCR法。取各組小鼠右肺組織解融，剪碎后研磨，制備成勻漿。使用TRIzol法提取小鼠右肺組織的總RNA，使用Nanodrop檢測RNA濃度及純度；逆轉錄合成cDNA；定量PCR擴增，反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s（40個循環）；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。E-cadherin mRNA上游引物5'-CGACCGGAAGTGACTCGAAAT-3'，下游引物5' -TCAGAACCACTGCCCTCGTAAT-3'；α-SMA mRNA上游引物5'-GTACCACCATGTACCCAGGC-3'，5' -GAAGGTAGACAGCGAAGCCA-3'；GAPDH 上游引物5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'；下游引物5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3'。以GAPDH 作為內參，以2-△△CT代表E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據處理。計量資料通過Shapiro-Wilk 進行正態性檢驗，符合正態分布的數據以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，通過Levene 檢驗進行方差齊性檢驗，方差齊時采用LSD-t法進行事后組間兩兩比較；方差不齊時進行Welch 檢驗，采用Tamhane's T2法進行事后組間兩兩比較，生存率采用Log-rank檢驗進行組間比較。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠左肺纖維化程度比較

2.1.1 各組小鼠左肺系數比較 第21 天時對照組小鼠死亡0 只，CGA 高劑量一組、二組分別死亡1只，CGA 中劑量、低劑量組分別死亡2 只，模型組死亡4只。CGA高劑量一組、CGA高劑量二組、CGA中劑量組、CGA 低劑量組、模型組及對照組小鼠的左肺系數分別為0.606 1% ± 0.007 4%、0.567 5% ±0.004 9%、0.852 6% ± 0.027 6%、1.304 5% ±0.035 6%、1.941 4% ± 0.027 3%、0.532 5% ±0.009 1%，與對照組相比，模型組小鼠左肺系數升高（P＜0.001）；與模型組相比，CGA 各劑量組小鼠的左肺系數降低（P均＜0.001），且呈劑量依賴性（P＜0.001）；與CGA 高劑量一組比較，CGA 高劑量二組小鼠左肺系數低（P＜0.001）。

2.1.2 各組小鼠左肺組織病理改變及Ashcroft 評分比較 對照組小鼠左肺組織結構正常，無肺泡間隔水腫，肺泡或支氣管壁可見少許膠原纖維；與對照組相比，模型組小鼠肺組織肺泡腔狹窄、塌陷，肺泡間隔明顯增厚，成纖維細胞顯著增多，發生明顯纖維化，大面積纖維灶形成，肺組織結構嚴重破壞；與模型組相比，CGA 各劑量組小鼠肺組織結構破壞程度及膠原纖維沉積情況均得到不同程度的改善。CGA高劑量一組、CGA 高劑量二組、CGA 低劑量組、CGA中劑量組、模型組及對照組小鼠左肺組織Ashcroft評分分別為（2.33 ± 1.21）、（2.33 ± 1.21）、（4.33 ±0.82）、（3.33 ± 0.82）、（7.33 ± 0.82）、（0.67 ±0.82）分。與對照組比較，模型組小鼠左肺組織Ashcroft 評分高（P＜0.001）；與模型組比較，CGA 各劑量組小鼠肺纖維化Ashcroft 評分均低（P均＜0.001）；與CGA 低劑量組比較，CGA 高劑量一組小鼠肺纖維化Ashcroft評分低（P＜0.01）。

2.2 各組小鼠左肺組織α-SMA 蛋白相對表達水平比較 CGA高劑量一組、CGA高劑量二組、CGA中劑量組、CGA 低劑量組、模型組及對照組小鼠左肺組織α-SMA蛋白相對表達量分別為1.167 8 ± 0.014 3、1.141 8 ± 0.029 1、1.485 5 ± 0.018 5、1.724 1 ±0.054 7、2.215 3 ± 0.073 7、1.000 0 ± 0.029 4，與對照組比較，模型組小鼠左肺組織α-SMA 蛋白相對表達水平高（P＜0.001）；與模型組相比，CGA 各劑量組小鼠左肺組織α-SMA蛋白相對表達水平均低（P均＜0.001），且降低程度呈劑量依賴性（P＜0.01）。

2.3 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin 及TGF-β1、Smads2/3 蛋白相對表達量比較 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin 及TGF-β1、Smads2/3蛋白相對表達量比較見表1。

表1 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin、TGF-β1及Smads2/3蛋白相對表達量比較（± s）

表1 各組小鼠左肺組織Collagen Ⅰ、Vimentin、TGF-β1及Smads2/3蛋白相對表達量比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與CGA 低劑量組比較，&P＜0.001；與CGA 中劑量組比較，▲P＜0.01；與CGA 高劑量一組比較，▼P＜0.001。

組別CGA低劑量組CGA中劑量組CGA高劑量一組CGA高劑量二組對照組模型組Collagen Ⅰ0.127 8 ± 0.006 4*#0.104 3 ± 0.003 5*#&0.084 0 ± 0.001 9*#&▲0.062 0 ± 0.005 2*#▼0.039 5 ± 0.003 6 0.216 2 ± 0.007 3*Vimentin 0.201 7 ± 0.006 5*#0.152 8 ± 0.006 6*#&0.129 0 ± 0.003 0*#&▲0.104 2 ± 0.004 8*#▼0.090 2 ± 0.004 7 0.266 8 ± 0.012 5*TGF-β1 0.141 0 ± 0.002 8*#0.117 8 ± 0.001 0*#&0.103 5 ± 0.002 2*#&▲0.085 2 ± 0.002 8*#▼0.064 5 ± 0.004 6 0.186 3 ± 0.014 2*Smad2/3 0.213 8 ± 0.004 1*#0.184 8 ± 0.001 8*#&0.162 0 ± 0.003 6*#&▲0.126 2 ± 0.002 8*#▼0.092 8 ± 0.002 7 0.255 2 ± 0.013 7*

2.4 各組小鼠右肺組織中MDA含量比較 CGA高劑量一組、CGA 高劑量二組、CGA 中劑量組、CGA 低劑量組、模型組及對照組小鼠右肺組織中MDA含量分別為（1.76 ± 0.08）、（1.58 ± 0.11）、（1.77 ±0.10）、（1.81 ± 0.08）、（1.82 ± 0.12）、（1.20 ± 0.18）nmoL/mgprot。與對照組比較，模型組小鼠右肺組織MDA含量高（P＜0.001）；與模型組比較，CGA高劑量二組小鼠右肺組織MDA含量低（P＜0.01），CGA高劑量一組小鼠右肺組織MDA含量與模型組的差異無統計學意義（P＞0.05）；與CGA 高劑量一組比較，CGA高劑量二組小鼠右肺組織MDA含量低（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對表達水平比較 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對表達水平比較見表2。

表2 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對表達量比較（± s）

表2 各組小鼠右肺組織E-cadherin及α-SMA mRNA相對表達量比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與CGA 低劑量組比較，&P＜0.01；與CGA中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別CGA低劑量組CGA中劑量組CGA高劑量一組CGA高劑量二組對照組模型組E-cadherin mRNA 0.141 1 ± 0.032 3*0.332 5 ± 0.078 8*#&0.472 2 ± 0.053 8*#&▲0.385 0 ± 0.067 2*#1.003 9 ± 0.110 3 0.068 3 ± 0.059 1*α-SMA mRNA 6.064 6 ± 0.677 4*#2.946 1 ± 0.560 4*#&1.776 9 ± 0.125 4#&▲1.225 3 ± 0.056 3#1.133 6 ± 0.720 9 11.757 7 ± 0.608 4*

3 討論

IPF 的發病機制至今尚未完全明確，涉及復雜的細胞及分子機制。目前普遍認為：遺傳和環境等多種因素共同作用，導致肺泡上皮細胞（AECs）反復損傷和異常修復，誘導產生TGF-β、血小板源性生長因子（PDGF）、結締組織生長因子（CTGF）、血管內皮生長因子（VEGF）及白介素-13（IL-13）等多種促纖維化細胞因子和生長因子，致使肺微環境內抗纖維化和致纖維化因子失衡，促進EMT 過程，使成纖維細胞、肌成纖維細胞等間葉細胞活化、增殖和募集，并分泌大量纖維性ECM，促進肺基質僵硬和纖維化的惡性循環，最終致使肺結構破壞和功能喪失［6］。因此，AECs 可以被認為是肺纖維化的啟動因子，在疾病的發生和發展中發揮的關鍵作用，IPF 被認為是一種“上皮細胞驅動疾病”，E-Cadherin 是上皮細胞之間的粘附連接的關鍵分子，是一種鈣依賴性細胞粘附跨膜糖蛋白，被認為是典型的上皮標志，并且E-Cadherin 下調在EMT 中起著核心作用；而肌成纖維細胞被認為是肺纖維化的關鍵效應因子，肌成纖維細胞特征性表達α-SMA，具有收縮、遷移的能力，同時仍保持成纖維細胞的功能和特性；TGF-β1是目前最有效的生長因子，被認為是參與IPF 發生發展最關鍵的成纖維因子，它可以誘導大量成纖維細胞增殖、遷移并分化為肌成纖維細胞，這些成纖維細胞對凋亡表現出抗性，并積聚在成纖維細胞灶的活性纖維化部位，導致細胞外基質的過量生產和沉積；在肺纖維化的進展過程中，EMT 也有助于肌成纖維細胞的擴張，導致纖維化過程的發展和維持［12］。因此，抑制肺成纖維細胞的增殖和活化，促進肌成纖維細胞凋亡，阻斷EMT 過程對于肺纖維化的治療至關重要。文獻［13］中報導TGF-β1可通過Smad 蛋白依賴型信號傳導通路誘導EMT，在肺纖維化中發揮重要作用。本研究結果發現，模型組小鼠肺組織中E-Cadherin等上皮細胞表型的表達水平明顯降低，而Vimentin、α-SMA等間質細胞標記物表達水平明顯升高，表明博萊霉素誘導的小鼠肺纖維過程中發生了EMT，若能有效抑制EMT過程的發生，可能延緩甚至終止肺纖維化進展。與此同時，模型組小鼠肺組織中TGF-β1/Smads 信號通路中的TGF-β1、Smad2/3 蛋白表達水平明顯升高，表明TGF-β1/Smads 信號通路在博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化過程中被激活。

小鼠單次氣管內注射博萊霉素后1～7天為急性損傷和炎癥期，大量活性氧產生，介導脂質過氧化等氧化應激反應，MDA是脂質過氧化的最終產物，其水平變化可直接反映組織中脂質過氧化程度及間接反映氧自由基含量，還可衡量機體氧化應激反應程度；博萊霉素作用后7～14 天是炎癥向纖維化活躍期的過渡階段；博萊霉素作用后第3 周為慢性纖維化階段，肺泡內和間隔纖維化形態明顯。本研究使用博萊霉素單次氣管內注射誘導實驗小鼠肺纖維化，模型組小鼠肺系數明顯升高；HE染色可見肺泡結構破壞，肺泡間隔增厚明顯，肺泡塌陷，肺泡腔縮小、甚至閉塞，大量纖維細胞增生；Masson染色可見明顯的藍色膠原纖維沉積，Ashcroft 評分明顯升高；免疫組化可見肺組織中Collagen Ⅰ等膠原蛋白表達水平明顯升高；表明成功誘導小鼠肺纖維模型。此外，模型組小鼠肺組織MDA 含量明顯升高，表明博萊霉素誘導的小鼠肺纖維過程中發生了脂質過氧化反應。

CGA 來源廣泛，其安全性已經得到了證實，具有多種藥理特性。CGA 可防止肝纖維化過程中造血干細胞和成纖維細胞的氧化應激、炎癥和纖維化；可抑制與腎纖維化相關的氧化應激、炎癥和纖維化；可減輕與心臟纖維化相關的氧化應激和炎癥［10］。本實驗研究發現：各劑量CGA 干預組的小鼠肺系數降低，肺組織結構破壞程度得到不同程度的減輕，Collagen Ⅰ等膠原纖維沉積減少，Ashcroft 評分降低，肺組織纖維化程度得到不同程度的改善。與此同時，CGA 干預后可明顯上調小鼠肺組織EMT 過程中的E-Cadherin 表達，下調Vimentin、α-SMA 表達，表明CGA 可抑制EMT 過程；在CGA 干預后TGF-β1、Smad2/3等與TGF-β1/ Smads信號通路相關的蛋白表達下調，表明CGA 可抑制肺纖維化過程中TGF-β1/Smads 信號通路。此外，CGA 高劑量二組小鼠肺系數及肺組織中的MDA 含量、Collagen Ⅰ蛋白表達較模型組低，且低于CGA 高劑量一組；表明早期予以CGA 干預能在一定程度上減輕小鼠在肺纖維化進程中的脂質過氧化程度，發揮抗氧化作用。

綜上所述，在一定濃度范圍內，綠原酸干預可減輕博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化程度，且呈劑量依賴性，其改善肺纖維化的作用機制可能與抑制TGF-β 1/ Smads 信號通路從而抑制EMT 有關。此外，綠原酸早期干預可減輕小鼠肺纖維化過程中脂質過氧化程度，從而在一定程度上協同減輕肺纖維化。