葡萄酒發(fā)酵技術及風味物質研究進展

龔鈺雯，劉鳳聽，伍淑婕，羅楊合，康 超

（1. 南寧學院食品與質量工程學院，廣西南寧 530200；2. 廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；3. 賀州學院 食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899）

0 引言

葡萄具有種植面積廣、品種豐富等特點，富含蛋白質、糖、有機酸等營養(yǎng)物質[1]。葡萄的加工產品是國內外一直研究的熱點。我國是最早釀造葡萄酒的國家之一。葡萄酒是用葡萄為原料破碎除梗后壓榨成葡萄汁，然后經過發(fā)酵制成的酒精飲品。使用葡萄的特點一般為顆粒小、果皮厚、果肉少、多汁且濃縮、葡萄籽占比大、果皮有澀味[2]。隨著時代的進步，人們對葡萄酒的風味品質要求越來越高，國外葡萄酒制作工藝成熟、風味豐富，而國內的葡萄酒產品和口味均比較單一，出現產品的同質化現象[3]。因此，我國越來越多的技術都運用在改善和提升葡萄酒口感風味方面。在食品加工過程中，風味物質的添加是改善食品品質和提高食品附加值的重要手段。目前，我國在葡萄酒加工中的風味物質添加主要集中在酯類、醛類和酮類等。主要的風味物質種類可分為呈香物質和呈味物質，呈香物質主要包括萜烯類、揮發(fā)酸、揮發(fā)酚，呈味物質主要包括糖類、酸類、酚類。發(fā)酵是整個葡萄酒制作工藝中最為關鍵的一步，決定了葡萄酒的色澤、口感和風味。通過介紹葡萄酒的3 種不同的發(fā)酵技術，以及葡萄酒的風味物質的種類、作用及影響因素，為今后葡萄酒的口感和風味的研究提供參考。

1 葡萄酒發(fā)酵技術

葡萄酒的發(fā)酵是多種微生物共同作用的結果，主要由酵母菌、細菌和霉菌三大類所影響，酵母菌中的釀酒酵母是整個發(fā)酵過程中的關鍵。釀酒酵母具有較強的嗜殺性，在酵母細胞內與其他微生物競爭營養(yǎng)，抑制其他微生物的生長。釀酒酵母能產生很多酶，對葡萄中糖分、色素等物質進行分解，是一種能將糖轉化為酒精的產酒菌。不同的釀酒酵母種類，所產的酒精含量也不同。釀酒酵母一般會在葡萄汁中繁殖2~3 d，在這個過程中不會將葡萄中原有的糖分完全轉化成酒精。抵御外界環(huán)境對葡萄酒發(fā)酵的影響；能產生硫化氫，其化合物是一種污染性物質，會產生刺鼻氣味，對葡萄酒的風味產生不良影響；具有絮凝性，用于葡萄酒的澄清；具有較高的耐受性，能順利進行酒精發(fā)酵[4-5]。隨著時代的發(fā)展，葡萄酒的發(fā)酵技術逐漸變得豐富多樣，主要介紹以下3 種發(fā)酵技術。

1.1 固定化細胞技術

固定化細胞（Immobilized cell） 通常指采用物理、化學手段鎖定在一定載體空間范圍內進行生殖代謝的動植物或微生物細胞[6]。固定化細胞技術常用于工業(yè)應用，可在冷凍干燥、加工和儲存過程中保持細胞活力，并有高操作穩(wěn)定性、增強細胞活力、提高發(fā)酵生產率、細胞控制和細胞回收、應用連續(xù)系統(tǒng)配置、提高最終產品質量等優(yōu)點[7]。其中，在酒精發(fā)酵方面，應用固定化細胞發(fā)酵可從組織中分離培養(yǎng)出大量的細胞，并對其進行培養(yǎng)、純化及鑒定，細胞純度高。而且，細胞制備過程中還可對其進行分離培養(yǎng)，使細胞獲得了更多的生長空間和營養(yǎng)物質、促進了其增殖與分化等功能；操作簡便，細胞可以根據需要進行包埋或包裹處理；抗雜菌能力增強、增加細胞濃度、提高酒精得率、提高設備利用率等特點[8]。張陽等人[9]將目標蛋白與釀酒酵母細胞壁蛋白融合，酵母表面會形成“真空層”，以此來削弱外界對BGL（β -葡萄糖苷酶） 的抑制作用，從而使葡萄酒的風味更加復雜，香氣更加濃郁。Canonicl L 等人[10]用固定化M. pulcherrima菌株與釀酒酵母對比，發(fā)現固定后的菌株生產的乙醇含量低于未固定化的1.38%（V/V），并沒有出現負面影響，而由于風味物質的增加，葡萄酒的口感更加豐富。但在酒精發(fā)酵過程中也存在著某些問題，如固定化載體結垢，是由于酒精發(fā)酵中雜質增多，灰分增加，導致結垢；還容易雜菌污染，固定化細胞反復使用，導致酶活力降低，或是細胞載體存在死角，有雜菌存在[11]。雖然固定化細胞技術有一定的缺陷，然而利用固定化細胞技術制得的葡萄酒，除了保留葡萄的果香和營養(yǎng)外，還具有醇厚的酒香味，從而受到很多消費者的喜愛。

1.2 微氧化技術

微氧化技術是法國最早運用在葡萄酒發(fā)酵上，在一定條件下，由于氧氣與其他氧化劑產生化學反應，進而產生過氧化氫等強氧物種和羥基自由基等強氧化性物質，其反應速度比常規(guī)工藝快數倍到幾十倍，具體是指將定量的氧氣送入高壓貯氣罐內，通過中間的緩沖池將氧氣傳送到發(fā)酵罐中，其次通過陶瓷擴散器將氧氣分散成細小的氣泡均勻地擴散到發(fā)酵罐中[12]。Dai Lingmin 等人[13]發(fā)現，微氧化（Mox） 可維持釀酒酵母群保持在一定的水平，提高酵母再Mox 中的存活時間，可延緩自發(fā)MLF 的發(fā)生，并提及Mox 的主要目標是加速葡萄酒化學成分的進化，從而提高葡萄酒的品質。氧氣的作用是改善酒的色澤，增強酒的風味。有研究通過高劑量氧氣處理，發(fā)現葡萄酒中色相與藍黃成分顯著升高，同時也增加了錦葵素- 3 - 葡萄糖苷- 乙基黃烷-3 -醇加合物和吡喃花青素的濃度，這些色素比游離花青素更穩(wěn)定，它們的形成與葡萄酒顏色的穩(wěn)定有關。其中發(fā)酵過程中酚類物質與氧氣相互作用，影響葡萄酒的色、香、味。酚類物質在鐵離子的作用下轉換成醌類，醌類與酚類進一步反應生成大分子褐色沉淀物，從而導致葡萄酒渾濁。花青素在微氧化過程中容易被氧氣氧化，使葡萄酒的色澤有所改變。單寧在微氧化過程中同樣被氧氣氧化，因此消耗了一定的氧氣，使花青素盡可能地減少氧化，保護了葡萄酒的顏色，減少苦澀感[14]。目前，國外對微氧化技術的研究比國內偏多，因此國外葡萄酒的發(fā)酵技術比國內成熟很多。

1.3 生物工程技術

生物工程技術在古代食品加工中就有運用，現在也是非常重要的加工技術。生物工程技術是20 世紀70 年代末由日本的Horipoka 教授首先提出的，是利用基因技術對生物體進行改造，使其能夠生產新的功能基因，從而使其能夠產生新的生物產品、藥物和化學品等的學科。其是指通過對生物體進行人工干預以產生新的遺傳性能，并賦予新功能而進行的一系列技術和工程[15]。生物工程技術主要是發(fā)酵工程、基因工程和酶工程這三大類，葡萄酒的發(fā)酵主要應用的使發(fā)酵工程技術。在葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵（MLF） 中，主要是利用發(fā)酵工程技術，是采用高菌密度的游離細胞能夠使MLF 快速啟動并且使反應進程容易控制[16]，也是一種利用微生物的特殊功能來生產功能性的產品的技術，如可獲得苷酸和氨基酸等營養(yǎng)物質，提高產品的營養(yǎng)價值。王曉勇[17]在堆積發(fā)酵與生物工程技術相結合時，汾酒的總酯含量有所提高，并且能優(yōu)化乙酸乙酯，提升汾酒的風味口感。Gianvito Paola Di等人[18]通過BPCs（應用基礎是接種微生物賦予生物保護活性的拮抗機制） 增加總滴定酸度和酯類濃度，降低葡萄酒的pH 值，將VOCs 應用到P.kluyveri酵母時，可觀察到葡萄酒的生物控制力受到了抑制，最終得出此拮抗機制對葡萄酒的質量有所貢獻。現在，生物工程技術已經被運用在葡萄酒的制作中，但其利用在葡萄酒的發(fā)酵方面研究還是較少，這也成為未來研究的難點和熱點之一。

2 葡萄酒的風味

葡萄酒風味物質的種類、含量直接影響到葡萄酒的風味口感。近年來，葡萄酒風味物質的研究是一個熱點，隨著生活質量的提高，愛酒人士對葡萄酒的風味物質需求也逐漸增加，因此風味物質是衡量葡萄酒品質的重要指標，也是影響消費者購買的重要因素，復雜平衡的風味有助于提高市場競爭力[19]。葡萄的風味物質包括主要呈味物質（糖類、酸類、酚類） 和主要呈香物質（萜烯類、揮發(fā)酸類、揮發(fā)酚類）。

2.1 呈味物質

葡萄酒中主要的呈味物質包括糖類、有機酸類和酚類。糖類是葡萄酒發(fā)酵中的重要組分，占比為17%~25%，主要包括葡萄糖、果糖、戊糖、蔗糖和多糖等。其中，葡萄糖和果糖能被酵母菌轉換成酒精，是發(fā)酵過程中必不可少的糖類。部分糖分可轉化成酯和酚酸類等物質，是形成葡萄酒特殊香氣的關鍵化合物，同時也對葡萄酒的風味具有重要的影響。有機酸包括可揮發(fā)、不可揮發(fā)有機酸，不可揮發(fā)有機酸類包括酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丙酮酸等，占比約為9%，其中蘋果酸和酒石酸占總體的90%以上[20]，乳酸、丙酮酸等主要在葡萄酒發(fā)酵過程中產生。酒石酸的酸味比較強，常用來提高原料酸度。蘋果酸需要乳酸菌進一步將其轉化，含量較高時能讓葡萄酒擁有酸澀感，使葡萄酒的口感更加細膩[21]。有機酸和糖類對葡萄酒的風味都很重要，有機酸的含量雖然低于糖類，但對葡萄酒的口感品質影響更大。酚類物質是葡萄酒的重要組成之一，對葡萄酒的色澤、口感、風味有一定的影響。酚類物質可分為黃酮類和非黃酮類，非黃酮類在葡萄中主要物質是酚酸，占比20%~25%，以游離形式存在；黃酮類主要有兒茶素、單寧、白藜蘆醇、花青素等[22]。因此，酚類物質不僅能夠提升葡萄酒的風味，還能夠預防癌癥、抗氧化等作用，在許多方面都有運用[23]。

2.2 呈香物質

葡萄酒中的呈香物質主要有萜烯類、揮發(fā)酸類、揮發(fā)酚類。萜烯類主要是以異戊二烯為結構單元構成的烴類化合物，是葡萄酒中重要的營養(yǎng)物質，對身體健康很有好處，不僅可以增強人體免疫力還具有抗菌的作用。其是以糖苷配基形式連接在β - D -葡萄糖上形成單糖苷，再進一步與其他糖鍵合生成雙糖苷或三糖苷，而且其中鍵合態(tài)的糖苷只有轉化為游離態(tài)的香氣成分才能被人的器官所感知[24]。葡萄酒中的揮發(fā)酸主要有甲酸、乙酸、丙酸等，其中乙酸是揮發(fā)酸的主體部分，約占90%[25]。在葡萄酒發(fā)酵過程中，會產生大量的揮發(fā)酸，當揮發(fā)酸含量過高時會產生異味，從而影響葡萄酒的風味與口感[26]。揮發(fā)酚類也是影響葡萄酒風味重要的組成之一。當酚類物質含量較高時，葡萄酒中會產生異味；含量較低時，對葡萄酒風味有促進作用[22]。

3 發(fā)酵技術對葡萄酒風味的影響

影響葡萄酒風味的影響因素有很多，如葡萄品種、環(huán)境因素（光照、氣候、土壤等）、發(fā)酵技術、貯藏方式等。發(fā)酵技術對葡萄酒的色澤、口感、品質起著決定性的作用，并且不同的發(fā)酵技術影響葡萄酒不同的風味。酵母菌在酒精發(fā)酵過程中將糖類物質轉化產生了酒精、CO2和其他物質，與揮發(fā)性物質及非揮發(fā)性物質一起形成了葡萄酒特有的風味。

固定化細胞技術通過構建共固定化體系，使多種微生物協(xié)調共生，再通過發(fā)酵形成豐富的酶系和產物體系，避免了各種菌株因發(fā)酵而發(fā)生突變，從而提高葡萄酒的風味和質量。有研究表明，將酵母固定在FSS 上，固定化后酵母比普通酵母生產出的酒含有微量的糖和11.12%~11.24% （V/V） 的酒精，有更好的透明度，同時還產生了甲酸和豐富的琥珀酸，和FSS 中含有的乙酸，一起增加了葡萄酒的香氣。Carmen B 等人[27]發(fā)現，釀酒酵母固定在橡木屑與纖維粉上，會顯著影響32 種揮發(fā)性物質中的20 種（IOC 18-2007 發(fā)酵得到的葡萄酒） 和27 種（55A 發(fā)酵得到的葡萄酒） 的濃度；當考慮揮發(fā)性化合物家族的總濃度時，固定化酵母中發(fā)現更多的酯類和酒精，還有產生的丁酸乙酯、己酸、辛酸、異戊酸和1-丙醇，都能增加葡萄酒香氣的復雜性。Anastasios N等人[28]運用釀酒酵母凍干固定化Kefir 培養(yǎng)物，得出了固定化酵母會使發(fā)酵時間變短、乙醇生產率為55.3 g /（ld），而且乙醛和乙酸乙酯濃度處于較低水平，增加了葡萄酒的果味特征，使得葡萄酒的氣味增加；還在發(fā)酵過程中發(fā)現了十六酸乙酯（糖果、草藥、辛辣氣味），辛酸、正癸酸以底氣味閾值限值而聞名，會影響到葡萄酒的風味。

微氧化技術中的氧氣可以改善葡萄酒的色澤，其中酚類物質與氧氣結合生成醌類，乙醇轉變?yōu)橐胰鼈兊漠a物會使葡萄酒變渾濁，之后生成的乙酸乙酯，也會影響葡萄酒的風味。同時，單寧對葡萄酒中的苦澀感有影響，而在微氧過程中，葡萄酒中單寧容易被氧化，苦澀感下降。Yang Yi 等人[29]發(fā)現Mox 用量越大，SO2總濃度下降幅度越大，葡萄酒顏色的發(fā)展產生了負面影響；Mox 處理對單寧濃度沒有影響，然而在單寧成分方面發(fā)現，（-）-表兒茶素延伸單位、沒食子酰化和平均單寧聚合度顯著升高，但（-）-表兒茶素末端單位和單寧三羥基化顯著降低，表明對澀味強度有長期的負面影響。Zhang Z 等人[30]通過Mox 與傳統(tǒng)發(fā)酵技術進行對比，發(fā)現Mox處理后葡萄酒中的總酚、單寧、游離花青素含量低于傳統(tǒng)發(fā)酵，使其澀味減少，擁有更好的顏色穩(wěn)定性；但酯類化合物沒有受到影響，苯甲醛增加19.9%~228%，雙乙酰增加15.6%~95.1%，最終發(fā)現Mox 處理會使葡萄酒中的干果味、花香味、堅果味增強，動物味減弱，也能去除綠色氣味，從而提高葡萄酒的品質。

生物工程技術中的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝難以控制葡萄酒發(fā)酵產物的穩(wěn)定性，而現代發(fā)酵技術會根據發(fā)酵過程中發(fā)酵產物的含量和酶的活性選擇特定的菌株或酶，不僅可以縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵效率，還可有效避免細菌污染，保證發(fā)酵過程的穩(wěn)定和安全，并提升葡萄酒的整體風味[31]。Ruiz-Mu?oz M等人[32]發(fā)現，非酵母菌在純培養(yǎng)物和基酒，以及僅含有乙醇和甘油作為碳源的培養(yǎng)基中，具有高的乙醇耐受性和生物活性，其中可提高5.5%~7.0%（V/V） 的耐受性，酵母菌株中的β -葡萄糖苷酶活性通過破壞糖苷鍵從非揮發(fā)前體中釋放萜烯和其他揮發(fā)性化合物，從而提高葡萄酒的風味。

4 結語

雖然葡萄酒的發(fā)酵技術種類豐富多樣，關于發(fā)酵技術的研究越來越多，但完全投入到葡萄酒工廠中的發(fā)酵技術仍單一。了解到葡萄酒發(fā)酵技術的研究進展，有了新的研究方向：選擇不同品種的葡萄原料，提高葡萄酒的品質；通過發(fā)酵技術來提升葡萄酒風味和品質的方向；研究不同的發(fā)酵技術提高葡萄酒的發(fā)酵效率，提升葡萄酒的風味，進一步研究討論，從而提高葡萄酒的質量和品質。