光標測技術在心臟電生理和心律失常研究中的應用

李陽鵬，鄭雨晴，李劍鴻，陳唐葶，譚曉秋，2

1.西南醫科大學心血管醫學研究所，醫學電生理學教育部重點實驗室，醫學電生理四川省重點實驗室（瀘州646000）；2.西南醫科大學基礎醫學院（瀘州 646000）

心律失常（cardiac arrhythmia）是一種臨床上常見的心血管疾病，可單發也可與其他心血管疾病伴發，嚴重的心律失常可導致心源性猝死。因此，深入探究心臟電生理和心律失常機制尤為重要[1-2]。心律失常發生機制復雜[3-7]，研究心律失常的方法也多種多樣[8-9]，包括從單細胞水平的膜片鉗到組織層面的多通道電標測和整體水平的電生理記錄。隨著心臟電生理研究技術不斷更新，越來越多心律失常的發病機制被揭示[10-11]。但是，作為一個功能合胞體，心臟在發生心律失常時其整體電活動表現、局部傳導異常機制、以及心臟各區域之間的聯系無法直觀的研究和顯示[12]，這使得心臟電生理研究的發展在相當長一段時間都停滯不前。20 世紀末，隨著熒光探針技術和高分辨率采集技術的出現，光標測技術應運而生并被用于神經系統的研究。由于心臟與神經系統的相似性，光標測技術被應用到心臟組織并逐漸成為研究心臟電生理功能的主要技術之一，對心臟電生理研究發揮了重要作用。此后，心臟電生理的研究不再局限于孤立的細胞或整體水平，器官水平的心律失常機制研究更為深入。通過心臟光標測技術，可以實現對心臟心肌細胞膜電位和胞內鈣瞬變的同步記錄[13]，研究者可以直觀地觀察到心律失常發生前后心臟電信號和鈣信號的整體變化，如異位激動、折返形成的位置和異常傳導過程，從而加深對心律失常的認識，促進心臟電生理研究的深入[12]。本文就光標測技術及其在常見疾病模型下的應用進行了評述，并為抗心律失常藥物的研究提供技術參考。

1 心臟光標測技術原理

電壓敏感染料是一種雙極性分子，可以穩定結合到細胞膜的磷脂雙分子層，它們可以感受細胞膜內外的電場力變化而做出適應性的結構改變，在激發光的作用下，這種結構改變會導致其熒光強度發生改變，從而準確地反映膜電位的實時變化，因此，染料的熒光強度可以間接地反映膜電位的變化[12,14-16]。同樣的，胞內鈣活動與動作電位呈現類似的規律變化，因此，使用鈣敏感染料可對胞內鈣離子進行標記，鈣染料熒光強度的變化可以反映胞內鈣濃度或鈣瞬變的變化[17-18]。具體的光學原理為：在染色結束后，熒光染料分子與細胞膜或胞內鈣離子有效結合，使用530 nm 的激發光照射心臟，電壓染料和鈣染料的發射光（電壓染料RH237發射光波峰為670 nm，鈣染料Rhod-2AM 發射光波峰為580 nm）被相機鏡頭收集（圖1A），通過幾種濾光片將兩種不同波長的熒光信號分離，采用EMCCD高速相機采集熒光信號，即可在采集系統上同時獲得瞬時膜電位（動作電位）和鈣瞬變的信號[19-20]（圖1B）。光標測技術是一種將熒光探針技術與高分辨率采集技術相結合的實驗技術，實驗數據豐富，運用特定的軟件可完成對心臟整體或區域性電生理行為的分析和研究[21-22]。

光標測技術較其它電生理技術的優勢：①高時空分辨率（時間分辨率——采樣頻率可達1 000 Hz，空間分辨率——最小像素點可達32 μm）；②廣闊的采樣面積——可達10 000 個像素點以上[19-20]，意味著可以標測哺乳動物心臟，如小鼠、大鼠、豚鼠等；③可以直接計算各個電生理參數在不同部位分布的差異；④可以從心臟整體層面觀察心臟電信號和鈣信號的傳導，了解心律失常發生時的起點和傳導路徑；⑤對心臟損傷小，信號不會受電磁場的干擾[14]。

2 光標測技術各參數在電生理研究中的應用

光標測技術發展迅速，在20世紀末出現后已逐漸成為心臟電生理研究的主要技術之一，多用于心臟電生理和多種心血管疾病模型的電生理變化研究及藥物的有效性評價。然而，要研究疾病模型下的心律失常機制，需對光標測的各個電生理參數有足夠的了解，并將其有序整理、分析，從而明確該疾病模型下或藥物干預后的電生理機制[22]。

2.1 動作電位

2.1.1 動作電位時程 動作電位時程（action potential duration，APD）不同時期的研究：工作心肌細胞動作電位分為0、1、2、3、4期，不同時期參與的離子通道不同，通過分析APD 的不同時間段，可以大致了解對應時段的離子通道的功能狀態[23-25]。動作電位時程與心律失常密切相關，動作電位延長被認為是造成心律失常易感性增加的一種機制，可能與復極化延長導致的延遲后去極（delayed after depolarization，DAD）或早后去極（early after depolarization，EAD）的發生率增加有關；同時結合動作電位有效不應期（effective refractory period，ERP）的測量，我們可以分析ERP與APD的比值來大致評價心律失常風險[26]。

2.1.2 動作電位異質性 不同心肌細胞電生理特性不盡相同,各個細胞間除極和復極時間可能存在差異，這種差異被稱為心肌動作電位異質性。在整體心臟中，光標測APD 熱圖可以直觀地觀察到，心房動作電位時程明顯短于心室，這是由不同功能區域心肌細胞離子通道的種類和數量決定的[27]，動作電位異質性的增加被認為是造成折返性心律失常的一種重要機制[25]。同樣的，活體心肌切片心內膜與心外膜的APD差異[19]，竇房結細胞與心房肌細胞APD的差異都是結構和功能的差異決定的。因此，可以將實驗組與對照組進行對比分析，明確實驗處理對于動作電位的影響，再分析具體影響的時段，從而更加深入的研究其中的分子機制，如某種離體通道是否存在數量和活性的改變[28]，或某些藥物通過影響離子通道活性影響動作電位時程。

2.1.3 動作電位的傳導 心臟正常的傳導方向為竇房結、左右心房、房室結、希氏束、左右束支及浦肯野纖維網[29]。通過對心臟的動作電位標記，可以研究在竇性節律下心臟電活動的起源和傳導路徑。因此，精準識別動作電位的傳導在研究心律失常中非常重要[30-31]。竇房結細胞是心臟中自律性最高的起搏細胞，因而作為心臟整體電沖動發放的領導者。2010 年，華盛頓大學EFIMOV團隊首次使用光標測技術解釋人竇房結起搏點和傳導路徑，實驗結果與經典理論相匹配，顯示出光標測技術在組織器官水平電生理研究的優越性[32]。而部分實驗需除去自身節律影響，采用額外刺激，此時心臟動作電位的傳導則為刺激點向遠處傳播，后續的數據分析可以定量計算動作電位傳導速度，而動作電位激活圖可直觀顯示傳導方向和傳導時間（圖1C）。通過對比傳導速度可以明確實驗組和對照組的傳導功能是否存在差異，再結合相關的分子實驗驗證，如縫隙連接蛋白的豐度變化等，可以深入進行心臟電生理和心律失常機制研究[33-34]。此外，心律失常期間也存在動作電位傳導的異常，可以分析激活圖或相位圖大致了解心律失常的起點和異常傳導路徑[34]。因此，光標測技術對于研究異位起搏點、折返、轉子等異常傳導方面體現出明顯優勢。

2.2 鈣瞬變的研究

動作電位產生過程中，0期大量內流的鈉離子導致細胞膜去極化，從而激活L型鈣通道，鈣離子進入胞內激活肌漿網的雷諾定受體（ryanodine receptor，RyR2），誘導鈣促鈣釋放過程，造成大量鈣離子從肌漿網進入胞漿，隨后肌漿網鈣離子ATP 酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）將鈣離子回收到肌漿網，整個過程即鈣瞬變過程[35-36]。與動作電位一樣，心臟不同區域或同區域不同類型組織的鈣瞬變也存在差異（圖1D）；鈣瞬變時程的延長或縮短一定程度說明肌漿網RyR2或SERCA活性的改變[37-38]，這在病理狀態下可能出現在整個心臟，也可能存在于局部病變部位及周邊區域。而且，鈣活動的紊亂與膜電位的異常密切相關，如舒張期異常的鈣釋放可能導致DAD 的形成，可能造成觸發活動進而誘發快速室性心律失常[39]。

2.3 動作電位和鈣瞬變耦聯關系的研究

正常心臟電活動功能的實現依賴于膜電位和鈣瞬變的協調配合，這是一個動態的、復雜的平衡關系。只有這樣，心臟的興奮才能正常傳導，心臟舒縮活動才可能有效進行。一旦這種平衡被打破，心臟的興奮傳導可能加快、延遲或阻滯，嚴重時會造成快速室性心律失導致心源性猝死[40]。2019 年，牛津大學雷鳴教授在Cardiovascular Research期刊的一篇綜述中指出膜鐘和鈣鐘與心律失常的關系，膜鐘和鈣鐘分別反映動作電位和鈣瞬變過程。作者指出，膜鐘激活產生鈣鐘，鈣鐘回饋膜鐘，二者相互協調配合，穩定膜電位正常傳導并維持胞內鈣穩態。不論是信號轉導異常還是離子通道功能改變，都會造成二者穩態的失衡引發心臟電活動的異常，即心律失常。二者的耦合關系被稱為latency（圖1E），即鈣鐘落后于膜鐘的時間，對于功能正常的心臟來說，這個時間是基本固定的，但心臟心功能異常時，這種耦合關系可能出現改變[41]。光標測在整體心臟水平同時記錄膜電位和鈣離子濃度變化，可分析動作電位和鈣瞬變之間的耦合關系并計算latency評價其心律失常易感性。本課題組利用光標測對老年鼠心臟檢測后發現，其latency較青年鼠顯著縮短，并且老年鼠心律失常發生率明顯增加，這提示鈣鐘的提前激活可能是造成老年鼠心律失常易感性增加的機制之一[42]。研究者在兒茶酚胺敏感的多形性室性心動過速模型的研究中發現，鈣異常釋放導致的胞內鈣超載引發鈉鈣交換體（sodium-calcium exchange，NCX）過度活化，引起DAD 誘發觸發活動，導致膜電位異常引發快速室性心律失常，這便是鈣鐘異常引起膜鐘異常的經典示例[39]。

3 光標測技術在心臟病理生理研究中的應用

心臟電生理研究的目的是為了深入了解疾病的電生理機制從而選擇更好的治療手段，通常的研究方法是用小鼠構建相關疾病動物模型。常見的心臟疾病動物模型有主動脈弓縮窄術誘導的左室肥厚伴心力衰竭（TAC）模型、心肌梗死模型（MI）、心臟缺血再灌注（IR）模型和遺傳性心律失常或心臟病模型[43]。不同的疾病模型，其電生理功能及發病機制不盡相同，但也存在聯系。通過分析這些模型的光標測實驗結果后發現，在TAC模型中，動作電位的激活時間明顯延遲，提示心臟電傳導功能降低[44]。通過心臟光標測明確了表型后可以分析影響心肌細胞動作電位傳導的相關因素，如心肌細胞縫隙連接蛋白含量或活性的下降，或者傳導系統功能的異常都可能造成心臟整體傳導功能的降低；同樣的結果可以在IR模型和MI模型中重復發現[45-48]，這可能與心肌細胞的損傷直接相關。總的來說，器質性心臟疾病的小鼠在基礎狀態下即出現鈣處理明顯異常（圖2A）和動作電位時程延長與傳導速度減慢（圖2B），并且區域間分布差異明顯，這可能是造成其心律失常易感性增加的原因。而非器質性病變的遺傳性心律失常和心臟病模型中，在基礎狀態下，這些小鼠心臟的血流動力學和電生理功能是基本正常的，但在應激條件，如兒茶酚胺干預、活動或情緒激動等刺激下，其動作電位傳導、鈣處理等電生理功能則發生明顯異常，常導致心律失常的發生[33-34]。

圖2 心臟異常事件分析Figure 2 Analysis of abnormal cardiac events

4 光標測技術在心血管相關藥物研究中的應用

目前心血管藥物的研究越來越多，新型藥物不斷出現，許多經典藥物的其它心血管作用不斷被發現，非心血管藥物在心血管疾病中的作用也逐漸被挖掘，光標測技術在評價這些藥物的電生理功能中發揮了重要作用。比如恩格列凈作為降糖藥被廣泛用于臨床，近年來有研究表明其在心血管疾病中具有保護作用。離體心臟光標測實驗發現，心梗小鼠使用了恩格列凈后，其惡性心律失常和DAD 發生率明顯降低，在發生快速室性心律失常時其主導頻率也相應降低，提示藥物干預后即使發生心律失常，其惡性程度也是明顯降低的；在鈣處理方面，恩格列凈明顯縮短了心梗小鼠的鈣處理時間和鈣衰減常數，提示恩格列凈通過對電生理調控改善心臟功能[49]。另外，急性心肌梗死和PCI術后的缺血再灌注在臨床中極為常見，二者通常出現心律失常易感性的增加，通過構建兩種疾病小鼠模型，進行光標測實驗發現，在缺血或梗死區，其傳導速度明顯減慢，且傳導方向發生偏移（圖2B），病變組織局部發生傳導阻滯，通過雷諾嗪干預，傳導速度有所恢復，傳導阻滯現象明顯減輕，且心律失常發生率明顯降低，這提示藥物通過改善心臟電傳導功能降低了心律失常易感性，直接證明了藥物的有效性。在大鼠無菌性心包炎模型中，作者使用白介素6（IL-6）抑制劑后發現，鈣交替（圖2A）程度明顯減弱，空間不均一交替發生率顯著降低，且雷諾定受體不應性明顯恢復，心律失常發生率明顯降低，提示藥物通過改善鈣處理減輕了大鼠心包炎致房顫的發作[50]。TAC術后小鼠心律失常易感性明顯增加，在高頻刺激后，其出現快速室性心律失常，光標測相位圖分析發現，在快速室性心律失常時，異位激動和折返形成是介導室性心律失常的主要表現（圖2C）。疾病狀態下，心臟病理性改變勢必導致心臟電生理重塑，光標測技術通過分析疾病狀態下的高通量電生理數據，通過差異性分析，從各個層面評價藥物對各電生理參數的影響，如動作電位時程的變化，動作電位傳導的異常，鈣處理的動力學改變等。因此，光標測技術逐漸在國內外心血管藥物研究發揮了重要作用。

5 小結與展望

光標測技術作為目前研究心臟電生理的新興技術，提供了高時空分辨率，同時獲得高通量的跨膜電位和胞內鈣處理的光學信號，在理解和研究心臟電生理及復雜心律失常時電傳導和鈣處理動力學中的作用尤為重要。然而，熒光染料和興奮收縮解偶聯劑對心臟的毒性作用，以及心臟離體后神經體液調節的缺失，難以獲得完全生理狀態下的電生理數據，且由于實驗技術本身的限制，光標測技術目前無法直接應用于臨床，僅在研究領域或臨床前階段使用，這是光標測技術目前的主要限制。隨著藥物研發技術的革新，不同靶分子的熒光探針被逐漸研發（如肌漿網鈣指示劑Fluo-5N AM、線粒體膜電位指示劑TMRE[51-52]），高分辨率采集技術和熒光探針技術的改進，以及近幾年全景光標測的提出[21，53]，心臟光標測技術勢必會取得日新月異的發展。相信在未來數十年，隨著技術的改進，我們對心血管疾病的研究會進一步深入，對心律失常發生機制的理解和干預也會更加全面。