敲低FAM83D調節宮頸癌細胞干細胞特性的作用及機制*

張 嵐,王靜依,劉述江,葉禮翠,吳欣瑜

(成都醫學院第二附屬醫院/核工業四一六醫院婦產科,成都 610057)

宮頸癌是發病率居首位的女性生殖系統惡性腫瘤,深入研究疾病的分子機制有助于發現新的治療靶點及預后標志物,對于精準制訂診療策略具有指導意義[1-2]。腫瘤干細胞是具有自我更新、多向分化潛能的腫瘤細胞,在惡性腫瘤發生、耐藥、復發、遠處轉移中均發揮重要作用,是近年來研究癌癥分子機制的熱門靶點[3-4]。Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)通路是調節腫瘤干細胞特性的重要信號通路,該通路激活后增加下游Sox2、Oct4基因的表達,進而促進癌細胞維持自我更新、多向分化的腫瘤干細胞特性[5-7]。序列相似性83蛋白質家族成員D(family with sequence similarity 83,member D,FAM83D)是新發現的一種原癌基因,在子宮內膜癌、卵巢癌等多種婦科惡性腫瘤中呈高表達狀態[8-9];另有相關基礎研究證實,FAM83D的促癌作用與激活Wnt/β-catenin通路有關[10-11],但該基因是否在宮頸癌中調控腫瘤干細胞尚不清楚。本研究將主要通過細胞實驗分析敲低FAM83D調節宮頸癌細胞干細胞特性的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本

選取2020年1月至2022年3月在本院手術切除的宮頸癌組織及對應癌旁組織。共納入65對組織標本,對應患者均經術后病理診斷為宮頸癌,術前均未接受放化療,平均年齡(59.39±9.23)歲,平均體重指數(22.83±5.52)kg/m2。

1.1.2細胞株

宮頸癌細胞株Hela、Siha、C33A及正常宮頸上皮細胞株H8均購自武漢普諾賽生命科技公司。

1.1.3主要儀器與試劑

陰性對照(NC)干擾小RNA(siRNA)、FAM83D siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司,NC短發夾RNA(shRNA)慢病毒、FAM83D shRNA慢病毒購自上海吉凱生物技術科技公司,總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司,兔來源FAM83D、Oct4、Sox2特異性一抗購自美國Abcam公司,β-catenin通路激動劑SKL2001購自美國MCE公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及分組處理

Hela、Siha、C33A、H8細胞均在含10%胎牛血清的培養基中貼壁培養,每2天更換1次培養基,待細胞鋪滿培養瓶底面80%后用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。傳代后的細胞接種在培養板內,用于FAM83D及干細胞標志基因表達的檢測。

將接種在培養板內的Hela細胞分為5組:si-NC組轉染NC siRNA,si-FAM83D組轉染FAM83D siRNA,二甲基亞砜(DMSO)+si-NC組在含有體積分數0.1% DMSO的條件下轉染NC siRNA,DMSO+si-FAM83D組在含有體積分數0.1% DMSO的條件下轉染FAM83D siRNA,SKL2001+si-FAM83D組在含有20 μmol/L SKL2001(含0.1% DMSO)的條件下轉染FAM83D siRNA。每組設置4個復孔,連續處理24 h,用于mRNA表達和蛋白表達的檢測。

將接種在培養皿內的Hela細胞進行分組:NC-shRNA組感染NC shRNA慢病毒,FAM83D-shRNA組感染FAM83D shRNA慢病毒,感染復數為10,感染24 h后更換為完全培養基,繼續培養72 h,而后將細胞用于瘤球形成實驗。在瘤球形成實驗過程中,同時加入體積分數0.1%的DMSO或20 μmol/L SKL2001,作為DMSO+NC-shRNA組、DMSO+FAM83D-shRNA組、SKL2001+FAM83D-shRNA組。

1.2.2熒光定量逆轉錄PCR檢測檢測基因mRNA表達水平

取宮頸癌組織和對應癌旁組織各約10 mg,以及接種在培養板內的Hela、Siha、C33A、H8細胞和分組處理的Hela細胞。采用總RNA提取試劑盒提取組織及細胞中的總RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒對組織及細胞中的總RNA進行逆轉錄、合成cDNA,最后采用熒光定量檢測試劑盒對FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA表達水平進行熒光定量逆轉錄PCR檢測,PCR反應體系如下:cDNA 1 μL、熒光定量檢測反應混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL,去離子水補足至20.0 μL。PCR反應程序:95 ℃ 3 min預變性;95 ℃ 15 s,特異性退火溫度(FAM83D 60 ℃、Oct4 58 ℃、Sox2 62 ℃)25 s,延伸72 ℃ 30 s,重復40個循環,反應結束后得到循環曲線及循環閾值(cycle threshold,Ct),以β-actin為內參,按照公式2-ΔΔCt計算FAM83D、Oct4、Sox2 mRNA表達水平。

1.2.3免疫組織化學檢測蛋白表達水平

取石蠟包埋的宮頸癌組織及對應癌旁組織,制作病理切片后進行免疫組織化學檢測。按照試劑盒說明書進行脫蠟、抗原修復,然后孵育FAM83D一抗(1∶200稀釋)、Oct4一抗(1∶150稀釋)、Sox2一抗(1∶200稀釋),磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍后孵育二抗(1∶200稀釋),PBS清洗3遍后加入卵白素-生物素-辣根過氧化物酶復合物(ABC)及二氨基聯苯胺(DAB)進行顯色,封片后在顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達水平

取分組處理的Hela細胞,加入裂解液后提取細胞蛋白,用二喹啉甲酸法(BCA)檢測蛋白水平后取30 μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,而后電轉至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶室溫孵育1～2 h,用叉頭框蛋白A2(FOXA2)一抗(1∶1 000)、β-catenin一抗(1∶500)或β-actin一抗(1∶5 000)4 ℃孵育過夜,次日室溫孵育二抗(1∶1 000)1 h。最后將硝酸纖維素膜放入凝膠成像系統,用電化學發光法顯影得到FAM83D、Oct4、Sox2及β-actin條帶,以β-actin條帶灰度值為內參,計算FAM83D、Oct4、Sox2蛋白表達水平。

1.2.5瘤球形成實驗檢測腫瘤干細胞特性

取慢病毒感染的Hela細胞,用無血清培養基重懸后接種在培養板內,加入1∶50稀釋的B27、20 ng/mL成纖維細胞生長因子(bFGF)、20 ng/mL表皮生長因子(EGF),每2天更換1次培養基,培養10 d后觀察長徑>30 μm的腫瘤細胞球并計數,細胞球形成率=球形結構數/初始種植細胞數×100%。

1.3 統計學處理

采用SPSS21.0軟件及Prism6.0軟件進行統計分析及制圖,宮頸癌組織與癌旁組織比較采用配對樣本t檢驗;細胞多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t法,兩組比較采用獨立樣本t檢驗;采用Pearson相關系數進行相關性分析;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸癌組織和癌旁組織FAM83D和干細胞標志基因及其蛋白表達水平比較

宮頸癌組織中FAM83D、Oct4及Sox2 mRNA相對表達水平均高于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.001),見表1。相關性分析顯示:宮頸癌組織中FAM83D mRNA與Oct4、Sox2 mRNA相對表達水平均呈負相關(r=-0.351、-0.332,P<0.05)。免疫組織化學檢測顯示:宮頸癌組織中FAM83D、Oct4、Sox2的染色強度均較癌旁組織增強,見圖1。

圖1 宮頸癌組織和癌旁組織FAM83D、Oct4及Sox2的表達(免疫組織化學染色)

2.2 宮頸癌細胞株與正常宮頸上皮細胞株中FAM83D和干細胞標志基因及其蛋白表達水平比較

宮頸癌細胞株Hela、Siha、C33A中FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA和蛋白相對表達水平均高于正常宮頸上皮細胞株H8,差異有統計學意義(P<0.05);并且,Hela細胞中FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA和蛋白相對表達水平均高于Siha、C33A細胞,差異有統計學意義(P<0.05),見表2、圖2。

a:P<0.05,與H8細胞比較;b:P<0.05,與Hela細胞比較。

表2 宮頸癌細胞株與正常宮頸上皮細胞株中FAM83D、 Oct4及Sox2 mRNA相對表達水平比較

2.3 敲低FAM83D對Hela細胞干細胞特性的調控作用

si-FAM83D組Hela細胞中FAM83D、Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相對表達水平均低于si-NC組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。FAM83D-shRNA組Hela細胞中FAM83D mRNA及蛋白相對表達水平,以及細胞球形成率均低于NC-shRNA組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。

A:FAM83D、Oct4及Sox2 mRNA相對表達水平比較;B:FAM83D、Oct4及Sox2蛋白相對表達水平比較;a:P<0.05,與si-NC組比較。

A:FAM83D mRNA及蛋白相對表達水平比較;B:細胞球形成率比較;a:P<0.05,與NC-shRNA組比較。

2.4 敲低FAM83D對Hela細胞中β-catenin表達的調控作用

si-FAM83D組Hela細胞中β-catenin mRNA及蛋白相對表達水平均低于si-NC組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖5。

A:β-catenin mRNA相對表達水平比較;B:β-catenin蛋白相對表達水平比較;a:P<0.05,與si-NC組比較。

2.5 β-catenin通路激動劑SKL2001對敲低FAM83D抑制Hela細胞干細胞特性的影響

DMSO+si-FAM83D組Hela細胞中Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相對表達水平均明顯低于DMSO+si-NC組(P<0.05);SKL2001+si-FAM83D組Hela細胞中Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相對表達水平均明顯高于DMSO+si-FAM83D組(P<0.05),見圖6A、B。

A:Oct4、Sox2 mRNA相對表達水平比較;B:Oct4、Sox2蛋白相對表達水平比較;C:細胞球形成率比較;a:P<0.05,與DMSO+si-NC組或DMSO+NC-shRNA組比較;b:P<0.05,與DMSO+si-FAM83D組或DMSO+FAM83D-shRNA組比較。

DMSO+FAM83D-shRNA組Hela細胞的細胞球形成率低于DMSO+NC-shRNA組,SKL2001+FAM83D-shRNA組Hela細胞的細胞球形成率高于DMSO+FAM83D-shRNA組,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖6C。

3 討 論

腫瘤干細胞學說是近些年備受關注的惡性腫瘤發病機制之一,該學說認為惡性腫瘤組織中存在一部分具有自我更新及多向分化潛能的癌細胞亞群,同時具有癌細胞特性和干細胞特性,可能既是惡性腫瘤發生、發展的起始細胞,也是惡性腫瘤復發轉移及耐藥的根源[12-14]。因此,闡明腫瘤干細胞特性的調控機制有助于深入認識惡性腫瘤的分子機制,進而發現新的分子標志物及治療靶點。

FAM83D基因是一種新發現的原癌基因,該基因編碼的蛋白質定位于紡錘體,是促進細胞有絲分裂的關鍵蛋白。有研究報道,子宮內膜癌[8]、卵巢癌[9]、乳腺癌[15-16]、肝癌[17-18]等惡性腫瘤組織中FAM83D的高表達與腫瘤病理進展及生存預后不良有關,提示FAM83D在惡性腫瘤發生、發展中起促進作用。本研究對宮頸癌組織及對應癌旁組織的檢測也證實宮頸癌中FAM83D表達水平明顯升高。另有基礎研究報道,FAM83D對多種癌細胞的增殖、遷移、侵襲、上皮間質轉化均具有促進作用,并且與激活Wnt/β-catenin通路[10-11]、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路[19-20]等信號通路有關。在受到FAM83D調控的信號通路中,Wnt/β-catenin通路對宮頸癌細胞腫瘤干細胞特性的維持具有促進作用。

基于上述認識,本研究就FAM83D對宮頸癌細胞干細胞特性的調控作用及機制進行了探索。(1)通過檢測臨床標本中干細胞標志基因表達水平證實,宮頸癌組織中Oct4、Sox2 mRNA表達水平高于癌旁組織,且與FAM83D mRNA表達水平均呈負相關,提示FAM83D可能在宮頸癌組織中參與癌細胞干細胞特性的調控。(2)設計細胞實驗進行驗證,在Hela、Siha、C33A 3種宮頸癌細胞中FAM83D及干細胞標志基因Oct4、Sox2的表達均高于正常宮頸上皮細胞,與宮頸癌組織中相應基因表達的變化趨勢一致。Hela細胞中FAM83D、Oct4、Sox2表達增加最明顯,在該細胞中轉染siRNA敲低FAM83D的表達后,細胞中Oct4、Sox2表達明顯降低;感染shRNA慢病毒敲低FAM83D的表達后,細胞球形成率明顯降低。以上結果表明敲低FAM83D對宮頸癌細胞的干細胞特性具有抑制作用。

Wnt/β-catenin通路是目前已知參與惡性腫瘤干細胞特性調控的信號通路[21-23],也是受到FAM83D調控的信號通路。本研究在Hela細胞中證實,敲低FAM83D的表達后,β-catenin表達水平明顯降低,表明FAM83D基因參與宮頸癌細胞中Wnt/β-catenin通路的調控。在此基礎上進一步分析Wnt/β-catenin通路在FAM83D調控宮頸癌細胞干細胞特性中的作用,在敲低FAM83D表達的同時聯合使用β-catenin激動劑SKL2001后,敲低FAM83D降低干細胞標志基因Oct4、Sox2表達及細胞球形成率的作用明顯被削弱,表明敲低FAM83D抑制宮頸癌細胞干細胞特性的作用部分與抑制Wnt/β-catenin通路有關。

綜上所述,宮頸癌組織及細胞株中FAM83D表達水平增加;敲低FAM83D明顯抑制宮頸癌細胞的干細胞特性,并且這一抑制作用與抑制Wnt/β-catenin 信號通路有關。