嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起斑馬魚腸道生理損傷和腸道菌群失調(diào)*

孫 雯 王永杰① 鮑俊杰 張 靜 陳紅蓮 熊英琪

嗜水氣單胞菌()引起斑馬魚腸道生理損傷和腸道菌群失調(diào)*

孫 雯1, 2王永杰1, 2①鮑俊杰1, 2張 靜1, 2陳紅蓮1, 2熊英琪1, 2

(1. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所 安徽合肥 230031; 2. 水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽合肥 230031)

研究分析了嗜水氣單胞菌()感染斑馬魚后腸道生理健康和腸道微生物的變化。以斑馬魚為研究對(duì)象, 刮傷皮下真皮, 使用105CFU/mL濃度的嗜水氣單胞菌暴露6 h后轉(zhuǎn)入清水, 分別在暴露前、暴露后6 h、12 h、24 h取樣。使用魚特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒, 檢測(cè)腸道中緊密連接蛋白ZO-2 (TJP2)含量和乙氧基異戊二烯-O-脫乙基酶(EROD)酶活性, 結(jié)果表明, 嗜水氣單胞菌暴露引起了斑馬魚腸道生理損傷, 表現(xiàn)為腸道TJP2含量、EROD酶活性在暴露后顯著下調(diào)。采用16S rRNA高通量測(cè)序檢測(cè)腸道微生物及其菌群結(jié)構(gòu)變化, 嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚后致病菌不動(dòng)桿菌屬()明顯增加, OTUs數(shù)量明顯下降, Alpha多樣性降低, 結(jié)果說明嗜水氣單胞菌引起了斑馬魚腸道菌群失調(diào)。腸道中微生物的多樣性與改善腸道上皮和黏膜屏障功能緊密相關(guān), 該研究對(duì)從腸道健康的角度評(píng)價(jià)嗜水氣單胞菌毒性, 探索嗜水氣單胞菌的致病機(jī)制具有重要意義。

嗜水氣單胞菌; 斑馬魚; 腸道微生物; Alpha多樣性; TJP2

嗜水氣單胞菌()在自然界中分布廣泛, 是一種典型的人魚共患病的條件致病菌, 感染致病性嗜水氣單胞菌可導(dǎo)致人腹瀉、食物中毒和繼發(fā)感染(楊守明等, 2006)。嗜水氣單胞菌感染魚類種類眾多, 可以引起羅非魚()、鯰魚()、鯉魚()等魚類細(xì)菌性敗血癥, 其致死率高、流行廣, 嚴(yán)重制約了中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展(Jones,1995; Da Silva, 2012; Prayitno, 2021; Chen, 2022)。因此, 研究嗜水氣單胞菌對(duì)魚類的致病性特征及其可能的致病機(jī)理, 對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

氣單胞菌的致病性與環(huán)境的變化(溫度變化、含氧量降低、氨氮升高)有關(guān)(白曉倩, 2016; 孟令杰, 2017; 孫元琛等, 2022)。目前有研究表明, 氣單胞菌感染的同時(shí)往往存在混合感染的情況(聶慧慧, 2016), 腸道微生物存在的共生菌通過競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì)和腸黏膜的附著點(diǎn)即生態(tài)位來抑制病原菌的生長增殖(查繼偉, 2019)。有研究表明, 芽孢桿菌益生菌添加在飼料中, 能夠增加中華絨螯蟹對(duì)嗜水氣單胞菌致病菌的抵抗力(陳文典, 2009), 氣單胞菌與其他細(xì)菌存在相互作用, 而它的致病性可能依賴于腸道菌群的組成(查繼偉, 2019)。

腸道是機(jī)體一種重要的免疫器官, 其中, 腸道微生物與腸道黏膜間的交流和免疫系統(tǒng)密切相關(guān)(徐紹剛等, 2019), 但目前人們對(duì)腸道微生物與腸道黏膜屏障的調(diào)控機(jī)制研究仍在初級(jí)階段。穩(wěn)定的腸道微生物區(qū)系影響著宿主的多種功能, 在宿主的生長發(fā)育、營養(yǎng)、食物消化、免疫反應(yīng)以及抵抗病原菌等方面發(fā)揮了重要作用(郭軍等, 2019; 盛鵬程等, 2020)。研究嗜水氣單胞菌對(duì)魚類腸道黏膜屏障及腸道微生物的影響, 對(duì)評(píng)價(jià)嗜水氣單胞菌毒性, 以及從腸道健康的角度, 探索嗜水氣單胞菌的致病機(jī)制具有重要意義。

斑馬魚因其體型小、生長快、完備的遺傳系統(tǒng)和基因組資源, 已成為脊椎動(dòng)物發(fā)育和人類疾病的重要模型(Neely, 2002)。本研究使用嗜水氣單胞菌暴露成年斑馬魚后, 采用ELISA和16S rRNA高通量測(cè)序, 檢測(cè)斑馬魚腸道生理指標(biāo)及腸道微生物的變化, 評(píng)價(jià)嗜水氣單胞菌對(duì)腸道健康的影響, 探索嗜水氣單胞菌可能的毒性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌(J5L09)來源于合肥養(yǎng)殖基地的患細(xì)菌性敗血癥異育銀鯽()體內(nèi)分離并保存于實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)所用的4月齡成年斑馬魚(, AB株), 從中國科學(xué)院水生生物研究所的斑馬魚育種中心(武漢, 中國)購買, 在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所進(jìn)行室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。

1.2 養(yǎng)殖及暴露實(shí)驗(yàn)

成年斑馬魚的養(yǎng)殖依據(jù)Yu等(2010)提出的養(yǎng)殖方案進(jìn)行。養(yǎng)殖過程中保持水溫在(28±0.5) °C, 光暗周期為14 h : 10 h, 每日喂食豐年蟲兩次。4月齡成年斑馬魚暫養(yǎng)14 d無死亡后開始暴露實(shí)驗(yàn)。麻醉后, 用無菌手術(shù)刀沿胸鰭后方側(cè)面刮除幾片鱗片, 并刮傷皮下真皮。麻醉恢復(fù)后用(105CFU/mL)嗜水氣單胞菌浸泡6 h后轉(zhuǎn)入清水中, 分別在暴露前和暴露后6 h、12 h、24 h時(shí)進(jìn)行取樣。

1.3 腸道采集

取樣前需禁食24 h, 用0.03%的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)對(duì)斑馬魚進(jìn)行麻醉, MS-222是一種經(jīng)過美國食品與藥物管理局(FDA)認(rèn)可的漁用麻醉劑, 且對(duì)人體和水產(chǎn)品沒有副作用。麻醉后使用無菌的剪刀和鑷子解剖, 取得的斑馬魚腸道放在無菌的EP管中。隨后立即使用液氮冷凍, 放置在–80 °C, 用于后續(xù)提取DNA。

1.4 腸道生理指標(biāo)的測(cè)定

把5條腸道混作一個(gè)樣, 加入9倍組織體積的生理鹽水。勻漿研磨充分后在3 000 r/min離心15 min, 取上清液。使用緊密連接蛋白ZO-2(TJP2)和乙氧基異戊二烯-O-脫乙基酶(EROD)的魚特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒, 按照說明書檢測(cè)腸道中TJP2含量和EROD活性, 試劑盒購買于南京建成。

1.5 腸道微生物群落總DNA提取

把10條腸道混作一個(gè)樣, 向每管樣品加入1 mL裂解液, 在37 °C下水浴30 min, 加入蛋白酶K (100 μg/mL), 隨后55 °C水浴下裂解12 h, 在室溫下恢復(fù)溫度后, 離心取其上清液, 再進(jìn)行抽提純化, 用氯化鈉(0.1倍體積)和無水乙醇(2倍體積)沉淀DNA, 3 h后用70%乙醇清洗DNA沉淀, 將DNA干燥后溶解于40 μL TE, 回收得到的DNA進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 16S rRNA高通量測(cè)序和分析

提取好的腸道菌群DNA用微量核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度, 以腸道細(xì)菌DNA為模板, 采用通用引物341F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)擴(kuò)增出細(xì)菌16S DNA序列。在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理過濾時(shí)(Fadrosh, 2014), 使用內(nèi)部撰寫的程序?qū)υ嫉臏y(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理, 基于OUT (Operational Taxonomic Units)聚類的Vsearch方法進(jìn)行序列拼接, 質(zhì)量過濾, 去重, 聚類(Rognes, 2016)。使用樸素貝葉斯(Naive Bayes)分類器完成注釋, 根據(jù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)各樣本在不同分類水平中的分類單元數(shù)量(唐亞鵬等, 2022)。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌暴露對(duì)斑馬魚腸道生理的影響

2.1.1 腸道中TJP2的含量 對(duì)暴露前后腸道中緊密連接蛋白TJP2的含量進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果如圖1, 在嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚12 h和24 h后, 腸道中TJP2的含量顯著降低(0.05,0.01)。

2.1.2 腸道中EROD酶活 檢測(cè)暴露前后腸道中EROD活性, 代表解毒能力的EROD活性隨暴露時(shí)間的增加而降低, 在嗜水氣單胞菌暴露24 h后, 斑馬魚腸道中EROD的活性顯著降低(0.01)。

圖1 斑馬魚腸道中TJP2的含量

注: 0表示未暴露前的斑馬魚腸道樣本, 6、12、24表示暴露后6 h、12 h、24 h的腸道樣本。數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM)。*<0.05表示暴露組相對(duì)于未暴露組具有顯著差異, **<0.01表示暴露組相對(duì)于未暴露組具有顯著差異具有極顯著差異。下同

圖2 斑馬魚腸道中EROD的活性

2.2 嗜水氣單胞菌暴露對(duì)斑馬魚腸道微生物的影響

2.2.1 樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和測(cè)序質(zhì)量分析 高通量測(cè)序后, 如表1所示, 共獲得有效序列條數(shù)為475 434條。把序列按照隨機(jī)抽樣的方法, 通過測(cè)序數(shù)據(jù)量以及OTU數(shù)量構(gòu)建稀釋曲線, 可見圖3中各樣本的曲線趨于平緩, 說明測(cè)序的數(shù)據(jù)量合理, 目前的OTU數(shù)量可以代表各組的微生物信息。

表1 各樣本數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)

Tab.1 Statistics of the sample data

注: A、B、C、D組分別為暴露前和暴露后6 h、12 h、24 h的腸道樣本, 每組分別設(shè)置3個(gè)平行

2.2.2 基于OTU的VENN圖 VENN圖顯示樣本中共有和獨(dú)有OTU數(shù)目, 表明樣品OTU數(shù)目的組成相似性和重疊情況, OTU的豐度能夠初步體現(xiàn)樣品的物種豐富程度。如圖4所示, 未暴露前, 斑馬魚腸道細(xì)菌獲得OTU 368個(gè), 在暴露后6 h、12 h、24 h后, 斑馬魚腸道細(xì)菌分別獲得OTU 246、253個(gè)、226個(gè)。

圖3 物種數(shù)目飽和度稀釋曲線

注: A組為未暴露前斑馬魚腸道樣本, B、C、D組分別為暴露后6 h、12 h、24 h的腸道樣本

圖4 基于OTU的VENN圖

2.2.3 腸道菌群的Alpha多樣性 Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析(Schloss, 2009), 反映樣品中群落的豐富度和物種均勻度。包括ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和Richness指數(shù)等。它們的指數(shù)越大, 說明樣品中的物種越豐富。相比未暴露嗜水氣單胞菌的對(duì)照組, 在暴露6 h、12 h、24 h后, 暴露組的Alpha多樣性顯著降低(圖5)。

2.2.4 Rank曲線 Rank曲線能夠展現(xiàn)樣品的物種多樣性, 也能夠反映物種的均勻程度和豐富程度。樣品曲線越寬表示樣品中物種組成越豐富, 樣品曲線越平坦表示樣品中物種組成的均勻度越高。由此可見, 暴露嗜水氣單胞菌后, 斑馬魚樣品中物種組成豐富度降低(圖6)。

圖5 Alpha多樣性指數(shù)

圖6 基于OTU的Rank曲線

2.2.5 門和屬水平物種豐度 如圖7所示, 在門水平上, 對(duì)照組腸道菌群中, 變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteriota)占主導(dǎo)地位, 但相對(duì)豐度不同。其中, 變形菌門所占比例為36.87%, 擬桿菌門所占比例為36.11%, 放線菌門所占比例為26.53%。值得注意的是, 在嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚12 h和24 h后, 放線菌門所占比例分別降低了28.95%和17.75%。

圖7 在門水平上的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)柱狀圖

在屬水平上(圖8), 與對(duì)照組相比, 暴露6 h、12 h、24 h后, 腸道菌群中顯著降低(0.05,0.05,0.05), 分枝桿菌屬()在暴露12 h、24 h后顯著降低(0.05,0.05), 腸道菌群中的不動(dòng)桿菌屬()在暴露24 h后也明顯增加。

2.2.6 主成分分析(PCA) 采用無參數(shù)多變量方差分析, 比較樣本的群落組成。圖9的結(jié)果顯示, 在暴露嗜水氣單胞菌12 h、24 h之后, 斑馬魚腸道菌群的相似度發(fā)生了偏移, 樣品在OTU水平上的群落組成存在差異。

圖8 在屬水平上的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)柱狀圖

圖9 斑馬魚腸道菌群的主成分分析

注: 圖中點(diǎn)分別表示各個(gè)樣品。不同顏色代表樣品屬于不同的分組。A組為未暴露前斑馬魚腸道樣本, B、C、D組分別為暴露后 6 h、12 h、24 h的腸道樣本

3 討論

腸道是消化和吸收營養(yǎng)的主要器官, 其完整性對(duì)魚類的健康至關(guān)重要(Jutfelt, 2007)。腸黏膜屏障功能的損傷與多種腸道疾病的發(fā)生密切相關(guān)(關(guān)瑋, 2011), 緊密連接(tight junction, TJ)蛋白是腸上皮屏障的關(guān)鍵成分(Chasiotis, 2012), TJP2是最重要的TJ蛋白之一, 常被用作腸上皮屏障完整性和通透性的指標(biāo)(Rhee, 2009)。本研究中, 在暴露嗜水氣單胞菌12 h、24 h后, 斑馬魚腸道中TJP2的含量顯著降低, 這表明, 嗜水氣單胞菌暴露損傷了腸上皮屏障的完整性, 提示了嗜水氣單胞菌對(duì)腸道功能有潛在的干擾作用。有研究表明, 感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚, 腸道組織切片上可觀察到有明顯的腸道上皮損傷, 腸道上皮結(jié)構(gòu)被破壞, 表現(xiàn)為上皮細(xì)胞脫落, 緣狀紋減少(Wang, 2016)。嗜水氣單胞菌可導(dǎo)致鯉魚腸道黏膜屏障損傷(Jung-Schroers, 2018)。嗜水氣單胞菌引起的金錢魚()細(xì)菌性疾病的發(fā)病金錢魚, 與正常的金錢魚相比, 其腸絨毛結(jié)構(gòu)消失, 肌肉層疏松明顯(張慶華等, 2016)。

本研究中, 在暴露嗜水氣單胞菌24 h后, 斑馬魚腸道中EROD活性顯著降低。EROD活性變化能夠反映機(jī)體解毒代謝的能力(肖國強(qiáng)等, 2013), 是公認(rèn)的魚類生物效應(yīng)標(biāo)記物(Kammann, 2005), 其活性可以指示暴露損傷(Whyte, 2000; J?nsson, 2003)。研究表明, 成年斑馬魚中, 暴露于50 mg/L對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methylparaben)會(huì)導(dǎo)致EROD活性顯著降低(De Carvalho Penha, 2021)。最高溫度導(dǎo)致暴露于除草劑丁硫脲(Butylthiourea)的美國牛蛙蝌蚪肝臟中EROD活性降低(Grott, 2021)。將黃蓋鰈()暴露于污染沉積物(低濃度多氯聯(lián)苯), 其EROD活性在140 d后下降22% (Livingstone, 1993)。本研究中, 暴露后腸道EROD活性的降低, 指示了嗜水氣單胞菌對(duì)斑馬魚腸道的生理損傷。

研究表明魚類在環(huán)境變化后, 一些從門到屬的OTUs會(huì)在腸道中大量改變(Adamovsky, 2018)。在本實(shí)驗(yàn)中, 嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚后, 腸道菌群中OTU數(shù)量明顯下降。Rank曲線表明, 暴露后組別比暴露前組別分布更窄, 物種組成豐富度降低。PCA分析結(jié)果顯示, 暴露改變了斑馬魚腸道菌群的結(jié)構(gòu)。通過Chao指數(shù)、Richness指數(shù)和ACE指數(shù)可以看出, 與對(duì)照組相比, 嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚后的Alpha多樣性顯著降低。很多研究也表明, 環(huán)境中的有害物質(zhì)暴露能夠?qū)е履c道菌群的改變以及Alpha多樣性的變化(Chen, 2018; Qiao, 2019)。重復(fù)損傷導(dǎo)致斑馬魚腸道屏障功能恢復(fù)受損, 腸道菌群失調(diào)(Chuang, 2019)。用含有二氯苯氧氯酚的食物暴露成年斑馬魚4～7 d, 可導(dǎo)致斑馬魚腸道菌群結(jié)構(gòu)快速變化、Alpha多樣性顯著降低(Gaulke, 2016)。本研究中嗜水氣單胞菌暴露后, 斑馬魚腸道菌群失調(diào), 表現(xiàn)為微生物物種組成減少, Alpha多樣性快速降低, 這指示了嗜水氣單胞菌暴露對(duì)斑馬魚的腸道損傷。與本研究結(jié)果不同的是, 采用長期浸泡的方法使嗜水氣單胞菌感染草魚, 導(dǎo)致草魚物種豐富度指數(shù)增加, Alpha多樣性有所增加(李東亮, 2016)。

在門水平上, 斑馬魚腸道菌群中變形菌門、擬桿菌門和放線菌門占主導(dǎo)地位, 但相對(duì)豐度不同。Roeselers等(2011)研究了在不同國家和地區(qū)的斑馬魚腸道菌群組成, 發(fā)現(xiàn)斑馬魚腸道中的核心菌群為變形菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門和擬桿菌門。在嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚12 h和24 h后, 放線菌門所占比例有所降低。本研究中, 在暴露嗜水氣單胞菌24 h后, 腸道菌群中的不動(dòng)桿菌屬()大量增加。動(dòng)桿菌屬是一種機(jī)會(huì)致病菌, 常存在機(jī)體呼吸道、消化道, 當(dāng)機(jī)體抵抗力較低時(shí)可致病(袁秀梅等, 2001)。人工感染結(jié)果表明, 不動(dòng)桿菌屬分離株對(duì)泥鰍、斑馬魚和線蟲()都具有致病性和高毒性(Wang, 2020)。本研究中腸道菌群不動(dòng)桿菌屬的大量增加, 可能是導(dǎo)致腸道健康受損的原因。

腸道健康, 包括黏膜上皮屏障功能完整和微生物平衡(Bischoff, 2011), 腸道黏膜屏障將宿主內(nèi)部與外部環(huán)境分隔開, 并阻擋潛在的有害物質(zhì)(姚鵬等, 2021), 腸道微生物對(duì)維持腸黏膜屏障功能、調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收等具有重要作用(段云峰等, 2022)。研究表明, 牙齦卟啉單胞菌()通過IL9產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞, 改變腸道菌群、破壞上皮屏障功能, 間接引發(fā)腸道炎癥(Sohn, 2022)?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌可改善拉氏鱥()腸道形態(tài)、消化和吸收酶活性, 增強(qiáng)腸道黏膜免疫和屏障功能, 維持腸道微生物平衡(Lei, 2022)。黏膜屏障功能障礙可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)(Xia, 2022), 石斛多糖能通過改善腸道屏障功能, 調(diào)節(jié)小鼠的腸道微生物群(胡乃華, 2022)。我們的研究結(jié)果表明, 嗜水氣單胞菌暴露引起了斑馬魚腸道生理損傷, 表現(xiàn)為腸道TJP2含量、EROD酶活性在暴露后顯著下調(diào)。分析斑馬魚體內(nèi)的腸道菌群種類發(fā)現(xiàn), 暴露后斑馬魚腸道內(nèi)致病菌不動(dòng)桿菌大量增加, 增加了腸道受損的可能性。進(jìn)一步對(duì)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明, 嗜水氣單胞菌暴露顯著降低了斑馬魚腸道中的微生物Alpha多樣性。腸道中微生物的多樣性與改善腸道上皮和黏膜屏障功能緊密相關(guān), 在本研究中, 腸道中致病菌的增加、Alpha多樣性的降低可能與TJP2含量、EROD酶活性降低有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究用嗜水氣單胞菌暴露斑馬魚, 在暴露后24 h內(nèi), 采用ELISA、16S rRNA高通量測(cè)序檢測(cè)腸道生理健康和腸道微生物變化情況。結(jié)果表明, 在嗜水氣單胞菌暴露后, 斑馬魚腸道健康受損。表現(xiàn)為斑馬魚腸道TJP2含量、EROD酶活性降低, 腸上皮屏障受損。同時(shí), 腸道致病菌增加, Alpha多樣性降低, 菌群失調(diào)。本研究結(jié)果提示了嗜水氣單胞菌對(duì)腸道健康的損害與風(fēng)險(xiǎn), 為腸道微生物與腸道生理健康的相互作用提供研究基礎(chǔ)。

白曉倩, 2016. 4株鱉源致病性嗜水氣單胞菌對(duì)氨氮和亞硝酸鹽的耐受與響應(yīng)特征[D]. 舟山: 浙江海洋大學(xué): 9-11.

關(guān)瑋, 2011. 益生菌與腸粘膜屏障[C] // 2011全國腸內(nèi)腸外營養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集. 鄭州: 中華醫(yī)學(xué)會(huì): 74-77.

孫元琛, 徐冰潔, 曹藝籌, 等, 2022. 飼料中添加納米氧化鈰對(duì)氨氮與嗜水氣單胞菌脅迫下中華絨螯蟹的保護(hù)效應(yīng)[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 18(3): 94-101.

李東亮, 2016. 感染嗜水氣單胞菌草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué): 33-36.

楊守明, 王民生, 2006. 嗜水氣單胞菌及其對(duì)人的致病性[J]. 疾病控制雜志, 10(5): 511-514.

肖國強(qiáng), 張炯明, 邵艷卿, 等, 2013. 苯并芘B[a]P對(duì)泥蚶組織EROD、GST酶活力和MDA含量的影響[J]. 海洋科學(xué), 37(8): 28-34.

張慶華, 馬文元, 陳彪, 等, 2016. 嗜水氣單胞菌引致的金錢魚細(xì)菌性疾病[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 40(4): 634-643.

陳文典, 2009. 兩種芽孢桿菌微膠囊制劑的研制及其對(duì)中華絨螯蟹免疫功能的影響[D]. 蘇州: 蘇州大學(xué): 34-56.

孟令杰, 2017. 溫度及細(xì)菌間作用對(duì)殺鮭氣單胞菌致病性的影響[D]. 青島: 中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所): 85-86.

胡乃華, 2022. 石斛多糖通過改善腸道屏障功能、調(diào)節(jié)腸道微生物群、減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)改善右旋糖酐-硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 34(1): 41.

查繼偉, 2019. 斑馬魚腸道菌群協(xié)同競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系對(duì)嗜水氣單胞菌感染的影響[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué): 3-4.

段云峰, 蔡峰, 律娜, 等, 2022. 益生菌促進(jìn)胃腸道健康的機(jī)制及應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào), 62(3): 836-847.

姚鵬, 郝娜, 2021. 腸屏障功能與消化系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志, 27(5): 785-787.

袁秀梅, 吳玲, 萬宏, 2001. 多重耐藥性溶血不動(dòng)桿菌致病人術(shù)后感染1例[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 19(5): 286-286.

聶慧慧, 2016. 鯉皰疹病毒Ⅱ與嗜水氣單胞菌混合感染致病性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué): 8-9.

徐紹剛, 張黎, 楊華蓮, 等, 2019. 鮭科魚類腸道微生物研究進(jìn)展[J]. 中國水產(chǎn)(1): 104-106.

郭軍, 吳杰, CHEN Y P, 等, 2019. 中華蜜蜂不同發(fā)育階段腸道微生物的特征[C] // 2000—2018中國蜂業(yè)科技前沿. 中國養(yǎng)蜂學(xué)會(huì): 11-12.

唐亞鵬, 董世瑞, 田吉騰, 等, 2022. 凡納濱對(duì)蝦()循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖效果及菌群結(jié)構(gòu)和功能研究[J]. 海洋與湖沼, 53(2): 466-474.

盛鵬程, 周冬仁, 韓新榮, 等, 2020. 不同飼養(yǎng)方式對(duì)烏鱧()腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異及種類多樣性的影響[J]. 海洋與湖沼, 51(1): 148-155.

ADAMOVSKY O, BUERGER A N, WORMINGTON A M,, 2018. The gut microbiome and aquatic toxicology: an emerging concept for environmental health [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 37(11): 2758-2775.

BISCHOFF S C, 2011. 'Gut health': a new objective in medicine? [J]. BMC Medicine, 9(1): 24.

CHASIOTIS H, KOLOSOV D, BUI P,, 2012. Tight junctions, tight junction proteins and paracellular permeability across the gill epithelium of fishes: a review [J]. Respiratory Physiology & Neurobiology, 184(3): 269-281.

CHEN L G, GUO Y Y, HU C Y,, 2018. Dysbiosis of gut microbiota by chronic coexposure to titanium dioxide nanoparticles and bisphenol A: Implications for host health in zebrafish [J]. Environmental Pollution, 234: 307-317.

CHEN J J, ZHAO Y D, SUN D D,, 2022. Improvement of intestinal barrier, immunity, and meat quality in common carp infected byusing probiotics [J]. Aquaculture International, 30(1): 33-49.

CHUANG L S, MORRISON J, HSU N Y,, 2019. Zebrafish modeling of intestinal injury, bacterial exposures and medications defines epithelialresponses relevant to human inflammatory bowel disease [J]. Disease Models & Mechanisms, 12(8): dmm037432.

DA SILVA B C, MOURI?O J L P, VIEIRA F N,, 2012. Haemorrhagic septicaemia in the hybrid surubim (×) caused by[J]. Aquaculture Research, 43(6): 908-916.

DE CARVALHO PENHA L C, COIMBRA ROLA R, DA SILVA JUNIOR F M,, 2021. Toxicity and sublethal effects of methylparaben on zebrafish () larvae and adults [J]. Environmental Science and Pollution Research, 28(33): 45534-45544.

FADROSH D W, MA B, GAJER P,, 2014. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq Platform [J]. Microbiome, 2(1): 6.

GAULKE C A, BARTON C L, PROFFITT S,, 2016. Triclosan exposure is associated with rapid restructuring of the microbiome in adult zebrafish [J]. PLoS One, 11(5): e0154632.

GROTT S C, BITSCHINSKI D, ISRAEL N G,, 2021. Influence of temperature on biomarker responses and histology of the liver of American bullfrog tadpoles (, Shaw, 1802) exposed to the herbicide Tebuthiuron [J]. Science of the Total Environment, 771: 144971.

JONES B L, WILCOX M H, 1995.infections and their treatment [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 35(4): 453-461.

J?NSSON M, ABRAHAMSON A, BRUNSTR?M B,, 2003. EROD activity in gill filaments of anadromous and marine fish as a biomarker of dioxin-like pollutants [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 136(3): 235-243.

JUNG-SCHROERS V, ADAMEK M, HARRIS S,, 2018. Response of the intestinal mucosal barrier of carp () to a bacterial challenge byintubation after feeding with β-1,3/1,6-glucan [J]. Journal of Fish Diseases, 41(7): 1077-1092.

JUTFELT F, OLSEN R E, BJ?RNSSON B T,, 2007. Parr-smolt transformation and dietary vegetable lipids affect intestinal nutrient uptake, barrier function and plasma cortisol levels in Atlantic salmon [J]. Aquaculture, 273(2/3): 298-311.

KAMMANN U, LANG T, VOBACH M,, 2005. Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) Activity in Dab () as Biomarker for Marine Monitoring (6 pp) [J]. Environmental Science and Pollution Research, 12(3): 140-145.

LEI X Y, ZHANG D M, WANG Q J,, 2022. Dietary supplementation of two indigenousspp on the intestinal morphology, intestinal immune barrier and intestinal microbial diversity of[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 48(5): 1315-1332, doi: 10.1007/s10695-022-01121-0.

LIVINGSTONE D R, LEMAIRE P, MATTHEWS A,, 1993. Pro-oxidant, antioxidant and 7-ethoxyresorufin-deethylase (EROD) activity responses in liver of Dab () exposed to sediment contaminated with hydrocarbons and other chemicals [J]. Marine Pollution Bulletin, 26(11): 602-606.

NEELY M N, PFEIFER J D, CAPARON M, 2002.- Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis [J]. Infection and Immunity, 70(7): 3904-3914.

PRAYITNO S B, RIYADI S, SARJITO,, 2021. The performance of survival and immunity of catfish () juvenile infected byafter treated by prebiotic extract in the diet [J]. Journal of Physics: Conference Series, 1943(1): 012083.

QIAO R X, DENG Y F, ZHANG S H,, 2019. Accumulation of different shapes of microplastics initiates intestinal injury and gut microbiota dysbiosis in the gut of zebrafish [J]. Chemosphere, 236: 124334.

RHEE S H, POTHOULAKIS C, MAYER E A, 2009. Principles and clinical implications of the brain-gut-enteric microbiota axis [J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 6(5): 306-314.

ROESELERS G, MITTGE E K, STEPHENS W Z,, 2011. Evidence for a core gut microbiota in the zebrafish [J]. The ISME Journal, 5(10): 1595-1608.

ROGNES T, FLOURI T, NICHOLS B,, 2016. VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics [J]. PeerJ, 4: e2584.

SCHLOSS P D, WESTCOTT S L, RYABIN T,, 2009. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities [J]. Applied and Environmental Microbiology, 75(23): 7537-7541.

SOHN J, LI L, ZHANG L X,, 2022.indirectly elicits intestinal inflammation by altering the gut microbiota and disrupting epithelial barrier function through IL9-producing CD4+T cells [J]. Molecular Oral Microbiology, 37(2): 42-52.

WANG X, LI J, CAO X J,, 2020. Isolation, identification and characterisation of an emerging fish pathogen,, from diseased loach () in China [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 113(1): 21-32.

WANG Y, REN Z, FU L,, 2016. Two highly adhesive lactic acid bacteria strains are protective in zebrafish infected withby evocation of gut mucosal immunity [J]. Journal of Applied Microbiology, 120(2): 441-451.

WHYTE J J, JUNG R E, SCHMITT C J,, 2000. Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity in fish as a biomarker of chemical exposure [J]. Critical Reviews in Toxicology, 30(4): 347-570.

XIA B, WU W D, FANG W,, 2022. Heat stress-induced mucosal barrier dysfunction is potentially associated with gut microbiota dysbiosis in pigs [J]. Animal Nutrition, 8: 289-299.

YU L Q, DENG J, SHI X J,, 2010. Exposure to DE-71 alters thyroid hormone levels and gene transcription in the hypothalamic-pituitary-thyroid axis of zebrafish larvae [J]. Aquatic Toxicology, 97(3): 226-233.

CAUSED INTESTINAL PHYSIOLOGICAL DAMAGE AND INTESTINAL MICROBIAL DISORDER IN ZEBRAFISH

SUN Wen1, 2, WANG Yong-Jie1, 2, BAO Jun-Jie1, 2, ZHANG Jing1, 2, CHEN Hong-Lian1, 2, XIONG Ying-Qi1, 2

(1. Fisheries Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China; 2. Key Laboratory of Aquaculture & Stock Enhancement in Anhui Provincial, Hefei 230031, China)

is widely distributed in nature, and is a typical opportunistic pathogen of common diseases of human and fish. To understand the mechanism of its infection to fish, zebrafish was taken for this study. The subcutaneous dermis of the sample fish was scratched, and the wounded fish was exposed tosolution at a concentration of 105CFU/mL for 6 h. Samples were taken at 0, 6, 12, and 24 h after exposure. The changes of intestinal physiological health and intestinal microbiota of the fish were analyzed. Fish specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit was used to detect the tight junction protein ZO-2 (TJP2) content and ethoxyisoprenoe-O-deethylase (EROD) activity in the intestine. Results show that after the exposure, the intestine of the zebrafish was damaged, and the intestinal TJP2 content and EROD enzyme activity were significantly down-regulated. As revealed by 16S rRNA high-throughput sequencing, the structures of intestinal microorganisms and their microbiota were altered,was significantly increased, the number of OTUs were significantly decreased, the Alpha diversity was decreased, and the dysregulation of the intestinal microbiota was caused. The diversity of intestinal microorganisms was closely related to the improvement of intestinal epithelial and mucosal barrier function. This study provided a reference for studying the toxicity offrom the perspective of intestinal health and exploring the pathogenic mechanism ofin zebrafish.

; zebrafish; intestinal microbial; Alpha diversity; TJP2

* 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目, 2022YL010號(hào); 安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng), 皖農(nóng)科函[2021] 711號(hào)。孫 雯, 碩士, E-mail: 936728828@qq.com

王永杰, 研究員, E-mail: hfwangyongjie@163.com

2022-10-08,

2022-11-17

S917.1

10.11693/hyhz20221000254