慢性間歇性低氧暴露對大鼠肝臟鐵代謝的影響及機制研究

宋紀顯, 陳 琦, 賈翠玲, 李博良, 張 智, 趙亞碩

(河北省中醫藥結合氫醫學技術創新中心/河北中醫學院, 河北 石家莊 050200)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是一種典型的呼吸系統疾病,最主要的病理特征是慢性間歇性低氧(Chronic Intermittent Hypoxia,CIH),可引起代謝紊亂及炎癥反應等,造成多器官損傷[1]。有研究證實CIH可導致十二指腸、肝臟、脾臟等器官的鐵代謝紊亂,但其具體機制尚不明確[2]。肝臟是調節鐵代謝的重要器官,其分泌的hepcidin是調控鐵穩態的主要物質,可參與鐵的吸收、釋放及利用[3],這主要依靠轉鐵蛋白-轉鐵蛋白受體1(Transferrin-Transferrin receptor 1,Tf-TfR1)、二價金屬離子轉運蛋白1(divalent metal-ion transporter 1,DMT1)、膜鐵轉運蛋白(Ferroportin 1,FPN1)及鐵存儲蛋白(Ferrtin)來實現[4]。研究表明hepcidin的表達受白細胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)等炎癥因子的調節,而CIH暴露后可誘導大量炎癥因子表達[5,6]。因此CIH暴露引起的炎癥反應可能影響hepcidin的表達進而造成機體鐵代謝失衡。故我們通過建立CIH大鼠模型,試圖闡明CIH暴露影響hepcidin進而造成肝臟鐵代謝紊亂的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物:SPF級雄性SD大鼠(200±20g),購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006,于河北中醫學院科研中心動物中心進行飼養(動物倫理編號:DWLL2020044)。

1.2主要試劑與儀器:亞鐵氰化鉀(Sigma-Aldrich,貨號:14459-95-1),血清鐵、總鐵結合力試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A039-1-1、A040-1-1),DMT1(+ire)、DMT1(-ire)抗體(Alpha diagnostic international,貨號:NRAMP21-S、NRAMP23-A),FPN1抗體(Alpha diagnostic international,貨號:543233S5),TfR1抗體(Invitrogen,貨號:13-6800),FTL抗體(Abcam,貨號:ab109373),STAT3、p-STAT3抗體(Affinity,貨號:AF6293、AF3294),β-actin抗體(Cwbiotech,貨號:CW0096)、反轉錄試劑盒、定量試劑盒(Takara,貨號:RR820A、RR047A),引物(Invitrogen),CIH氧艙(Oxyeycler Model 84,BioSpherix公司,美國)。

1.3動物模型和分組:在實驗開始前,適應性飼養一周。將SD大鼠(n=20)隨機分為常氧對照組(Normoxia)和模型組(CIH)。將模型組大鼠放置在動物間歇性低氧艙內,首先向艙內充入100% 氮氣,使氧氣濃度從21%降至5%,持續1.5min,后1.5min內向艙內充入100% 氧氣使氧氣濃度逐漸恢復到21%,每天8h,共35d(參考本課題組前期文獻進行)[7]。對照組大鼠在間歇性低氧艙內充入空氣,以保證其他環境條件一致。

1.4樣本采集:造模結束后,采用腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉,通過股動脈采取大鼠血液。然后取大鼠肝臟,部分固定在 4%多聚甲醛,用于HE 染色、普魯士藍染色,部分放入凍存管內于-80℃長期保存,用于Western blot及Q-PCR檢測。

1.5HE染色:采用HE染色觀察肝臟的結構。將石蠟切片進行脫蠟,梯度酒精復水。然后進行蘇木精染色、分化、伊紅染色,之后梯度酒精脫水,封片。然后在顯微鏡下觀察。

1.6血清鐵、TIBC測定:血清鐵,將血清鐵與顯色劑在100℃水中反應5min,離心后收集上清,在520nm處檢測吸收值。TIBC測定,將標準鐵(10mg/L)加入血清中室溫反應5min,離心收集上清液。將上清液與鐵顯色劑混合,100℃反應5min,然后在520nm處檢測吸收值。

1.7普魯士藍染色:切片脫蠟后用磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS pH=7.4)清洗,然后用3% H2O2室溫孵育20min,用PBS沖洗后于Perls’試劑中室溫浸泡6h。然后DAB加強,蘇木精染色,脫水,最后用中性樹脂封片,顯微鏡下觀察陽性細胞。

1.8Western blot:將肝臟組織裂解提取蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE將蛋白進行分離,然后轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶進行封閉后,孵育DMT1(+ire)、DMT1(-ire)、FPN1、TfR1、FTL、p-STAT3、STAT3、β-actin一抗4℃過夜。第2天TBST洗滌后,室溫孵育相應二抗1h。最后,采用ECL法進行化學成像,采用Image J軟件進行灰度值分析。

1.9Q-PCR:采用Trizol方法從肝組織中提取總RNA。取1μg RNA進行反轉錄提取cDNA。取40ng cDNA,加入基因特異性引物和2×SYBR Premix Ex Taq制成混合體系。采用實時定量PCR擴增儀進行檢測,反應步驟:孵育95℃ 5min,然后94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s共40個循環。引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

2 結 果

2.1CIH暴露后大鼠肝臟病理結構改變:在正常肝組織中,HE染色顯示肝索呈放射狀分布,圍繞肝小葉中央靜脈排列,未見炎性細胞浸潤。與對照組相比模型組肝臟細胞結構紊亂,胞漿中出現不同大小和數量的脂肪空泡,細胞核萎縮(見圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理變化(HE,n=6,×200,×400)

2.2CIH暴露后大鼠血清鐵含量變化:與對照組相比,模型組血清鐵含量及轉鐵蛋白飽和度顯著下降,未飽和鐵結合力顯著上升。對照組和模型組大鼠血清中總鐵結合力無顯著差異(見表2)。

表2 各組大鼠血清鐵血清總鐵結合力血清未飽和鐵結合力血清轉鐵蛋白飽和度水平

2.3CIH暴露后大鼠肝臟中鐵含量及FTL蛋白水平:普魯士藍染色結果顯示,與對照組相比模型組肝臟中鐵含量顯著增多(見圖2)。Western blot結果顯示,與對照組相比模型組大鼠肝臟FTL蛋白水平明顯上升(見表3,圖3)。

圖2 各組大鼠肝臟普魯士藍染色(n=6,×200,×400)

圖3 各組大鼠FTL蛋白表達水平

表3 各組大鼠FTL蛋白表達水平

2.4CIH暴露后大鼠肝臟中鐵代謝情況:與對照組相比,模型組DMT1(+ire) mRNA和蛋白水平,TfR1 mRNA和蛋白水平均顯著上升;DMT1(-ire) mRNA和蛋白表達無顯著變化(見表4、5,圖4)。與對照組相比,模型組肝臟FPN1 mRNA無明顯變化,蛋白水平顯著下降(見表5,圖4)。

圖4 各組大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1蛋白表達水平

表4 各組大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1 mRNA表達水平

表5 各組大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1蛋白表達水平

2.5CIH暴露后大鼠肝臟中hepcidin表達:與對照組相比,模型組肝臟hepcidin及IL-6 mRNA水平均顯著上升(見表6)。與對照組相比,模型組大鼠肝臟STAT3蛋白發生明顯磷酸化(見表7,圖5)。

圖5 各組大鼠p-STAT3/STAT 3蛋白表達水平

表6 各組大鼠hepcidin IL-6 mRNA表達水平

表7 各組大鼠p-STAT3/STAT 3蛋白表達水平

3 討 論

有證據表明OSA患者體內鐵蛋白水平明顯升高,且與疾病嚴重程度成正比[8]。機體為適應低氧環境,需要大量鐵元素以滿足氧氣運輸,肝臟作為體內調控鐵平衡的重要場所,也是受CIH影響的重要靶器官。當機體鐵過載時,肝臟能迅速吸收非轉鐵蛋白結合鐵(non-transferrin-bound iron,NTBI)并儲存在肝細胞中[9]。本研究發現CIH暴露后大鼠血清鐵含量和轉鐵蛋白飽和度下降而血清未飽和鐵結合力顯著上升,說明機體轉運鐵的能力下降;肝臟FTL蛋白表達上升,鐵沉積顯著增加;同時HE結果顯示CIH暴露后大鼠肝臟出現病理損傷,這說明CIH可以引起肝臟鐵沉積進而導致肝臟損傷。

肝臟中的鐵代謝,包括鐵的吸收、釋放和存儲都受到嚴格調控。機體鐵的吸收主要依靠TfR1和DMT1,二者分別吸收Fe3+和Fe2+,進入到機體中的鐵部分通過FPN1輸出進入循環系統以滿足生理活動需求,部分則儲存在鐵蛋白(Ferrtin)內[10]。本研究結果顯示,CIH暴露后大鼠肝臟中TfR1和DMT1(+ire)的表達顯著增加,而FPN1表達顯著下降,這表明在CIH暴露期間,肝臟鐵攝取增多、輸出減少,導致鐵沉積。

Hepcidin是調控系統鐵代謝的中樞因子,高水平的hepcidin會抑制FPN1從巨噬細胞和肝臟中輸出鐵,導致血清鐵的下降[11]。本研究發現肝臟中hepcidin mRNA水平顯著升高,這說明hepcidin表達增加導致FPN1表達下降可能是CIH暴露引起肝臟鐵超載的主要原因。Hepcidin作為一種抗菌肽,在受到炎癥刺激時會被誘導表達。IL-6能夠引起STAT3磷酸化,激活的STAT3可與HAMP啟動子中的應答元件結合,促進hepcidin的轉錄,上調hepcidin的表達[12]。本研究結果顯示,CIH暴露后大鼠肝臟中IL-6表達增加,p-STAT3/STAT3的比值也顯著上升,這表明CIH 暴露可通過IL-6/STAT3通路造成肝臟中hepcidin的高水平表達。

綜上所述,CIH暴露可以通過IL-6/STAT3通路導致肝臟hepcidin高表達,進而下調FPN1表達、增加TfR1和DMT1(+ire)介導的鐵攝取,造成肝臟鐵過載。這進一步闡明了CIH引起肝臟鐵超載的具體機制,但仍需臨床相關研究加以驗證。