丹參注射液通過誘導自噬抑制足細胞凋亡的研究

曾 慧，陳文良，黃文治

（廣東省中醫院，廣東 廣州 510120）

丹參注射液（Danshen injection, DSI）是一種從中藥丹參中提取的制劑，具有活血化瘀、通脈養心的功效，在臨床上主要用于治療心血管疾病，如冠心病、心絞痛等[1]。在中醫臨床上，瘀證是腎病常見的中醫證型，而丹參是活血化瘀的代表藥味，因而常被臨床上用于治療伴有瘀證的各種腎臟疾病[2-3]。研究表明，丹參中的多種主要成分可調控自噬，進而發揮調控細胞凋亡的作用，例如丹酚酸B 通過抑制細胞自噬和凋亡阻止糖尿病周圍神經病變的發展[4]。然而，DSI 對腎細胞自噬及凋亡的影響尚有待于進一步的研究。本文旨在研究足細胞中自噬與凋亡的關系及DSI 的干預作用，以期為DSI 在腎臟疾病中的應用提供體外的實驗數據參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DSI（正大青春寶藥業有限公司）；脂多糖（Sigma）；氯喹（Sigma）；雷帕霉素（Sigma）；P62抗體（Abcam）；Beclin1 抗體（CST）；β-actin 抗體（Abcam）；Caspase 3 抗體（CST）；Bax 抗體（CST）；Bcl-2 抗體（CST）；兔二抗（Abcam）；鼠二抗（Abcam）；BCA 測試盒（上海碧云天生物技術有限公司）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、Loading Buffer（康為世紀生物科技股份有限公司）；ECL 超敏發光液、0.45 μm PVDF 膜（Millipore）；MPC-5 細胞（上海酶研生物科技有限公司）；培養基（Gibco）；雙抗（Gibco）；胎牛血清（Biological Industries）；全波長酶標儀（Thermo）；光學倒置顯微鏡（Olympus）；全自動化學發光圖像分析系統（Tanon）。

1.2 細胞培養及干預

足細胞系MPC-5 購自上海酶研生物科技有限公司。使用RPMI-1640 培養基（10%胎牛血清，1%雙抗，50 U/mL INF-γ）培養足細胞，置于5% CO2的33 ℃恒溫培養箱中培養增殖。分化培養時，用RPMI-1640 培養基（10% 胎牛血清，1% 雙抗，1×Insulin-Transferrin-Selenium）培養，置于5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養14 d。脂多糖粉末用生理鹽水配置為10 mg/mL 的母液，DSI 原液用生理鹽水配置成不同稀釋比的濃度。根據前期實驗探索[5]，脂多糖造模濃度為4 μg/mL，DSI 稀釋比為1/640，氯喹最終干預濃度為20 μM，雷帕霉素的最終干預濃度為20 nM。

1.3 細胞總蛋白提取實驗

細胞實驗干預結束后，用PBS 預冷溶液潤洗培養板3 次，加入預冷裂解液（RIPA ：100× 蛋白酶抑制劑=99:1），80 μL/ 孔，將細胞刮下后收集至1.5 mL EP 管中，冰上裂解30 min，然后在4 ℃下以12 000 rpm 的轉速離心20 min，收集上清，用BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，用生理鹽水及Loading Buffer 將所有樣品配置為1 μg/mL 的終濃度。

1.4 Westernblotting 檢測

配置10% 的SDS-PAGE 分離凝膠系統，每孔上10 μL 制備好的蛋白樣品，垂直電泳槽1×電泳液中150 V 恒流電泳70 min。將凝膠上的蛋白通過200 mA恒流電泳60 min，使之轉印到0.45 μm 的PVDF 膜上。用5%的脫脂奶粉封閉1 h 后，4 ℃搖床慢速搖動孵育一抗過夜。次日用TBST 清洗2 次，每次10 min，孵育二抗1 h。再次用TBST 清洗2 次，每次10 min，用超敏發光液ECL 浸潤30 s 后在化學發光成像系統中顯影采集。得到的圖像通過ImageJ 1.53K 軟件統計灰度值，并與內參進行半定量比較。各抗體稀釋比如下：P62 抗體（1:1000）；Beclin1 抗體（1:1000）；β-actin抗體（1:1000）；Caspase 3 抗體（1:1000）；Bax 抗體（1:1000）；Bcl-2 抗體（1:1000）；兔二抗（1:5000）；鼠二抗（1:5000）。

1.5 統計學方法

使用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析，所有數據均以均數± 標準差（±s）顯示，在滿足正態性檢驗及方差齊性檢驗條件時（本文數據均滿足該條件），采用非配對的t檢驗進行兩組間的比較。當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯喹及雷帕霉素聯合DSI 干預對足細胞自噬的影響

為進一步探究DSI 對脂多糖誘導的足細胞凋亡及自噬的影響，我們給予氯喹及雷帕霉素干預，結果顯示，氯喹能夠促進P62 蛋白的表達，雷帕霉素則能下調P62 蛋白的表達水平及上調Beclin1 蛋白的表達水平，表明氯喹抑制了足細胞的自噬，而雷帕霉素則誘導了足細胞的自噬。與氯喹組相比，給予氯喹和DSI干預后足細胞的自噬水平明顯上調。與雷帕霉素組相比，給予雷帕霉素和DSI 干預后足細胞的自噬水平也出現明顯上調的趨勢（見圖1）。這一結果表明，DSI能夠逆轉氯喹造成的自噬阻滯，其激活自噬的活性與雷帕霉素有協同作用。

圖1 氯喹與雷帕霉素干預對足細胞自噬的影響及聯合DSI 的作用

2.2 DSI 通過干預自噬影響足細胞的凋亡

以氯喹及雷帕霉素干預后，評價DSI 對足細胞凋亡的影響，結果顯示，氯喹抑制了Caspase 3、Bcl-2 蛋白的表達，同時給予氯喹及DSI 干預后，Caspase3、Bcl-2 蛋白的表達上升，Bax 蛋白的表達下降。給予雷帕霉素誘導自噬后，足細胞的凋亡出現了明顯的上調趨勢。同時給予DSI 干預，足細胞的Caspase 3、Bax 蛋白水平顯著下降，Bcl-2 蛋白水平顯著上調。這一結果表明誘導足細胞自噬能夠抑制脂多糖導致的足細胞凋亡損傷，而抑制自噬則會導致脂多糖誘導的足細胞凋亡損傷加重（見圖2）。

圖2 氯喹與雷帕霉素干預對脂多糖誘導的足細胞損傷自噬的影響

3 討論

自噬和凋亡是細胞重要的生理活動，密切參與腎臟疾病的發展[6]。在腎臟中，足細胞是組成腎小球濾過屏障的重要細胞[7]。因而，足細胞的自噬和凋亡將直接影響腎臟濾過屏障的完整性。在脂多糖刺激的炎癥模型中，足細胞的自噬受損，此時細胞凋亡水平上升。自噬通過及時收集、降解細胞內的受損細胞器或翻譯錯誤的大分子等，從而實現細胞內的物質循環[8]。當足細胞的自噬受損后，物質循環效率降低，進一步導致細胞凋亡，形成惡性循環。此外，給予DSI 和自噬激動劑誘導足細胞自噬后，細胞凋亡水平明顯下降。表明在脂多糖模型中，自噬是起保護足細胞的作用，而DSI 則可以通過誘導自噬抑制足細胞凋亡。本研究通過應用自噬抑制劑和激動劑，闡明了足細胞自噬水平與細胞凋亡之間的關系。

綜上所述，本研究從足細胞自噬誘導凋亡的角度闡明了DSI 在腎臟保護中的作用機制，為擴大DSI 的臨床應用及腎臟疾病的治療提供了新思路。