蓽茇酰胺調控STAT3/HIF-1α通路抑制三陰性乳腺癌細胞增殖

白芙婷,姜 怡,郭宇航,張藏燁,王博韜,剡雨彤,周怡菲,孫 卓,陳 鏑

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)因高轉移、高侵襲、高復發等特點導致預后較差[1]。TNBC因缺乏有效靶點而主要依賴化療,然而化療藥物毒副作用大且易產生耐藥,導致患者預后不佳[2]。信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)通路是調控腫瘤細胞的關鍵通路。STAT3在惡性腫瘤中異常激活,是腫瘤治療的重要分子靶點。HIF-1α是STAT3的靶分子,可促進腫瘤增殖、血管生成和耐藥等。研究[3]顯示,白細胞介素-6通過激活STAT3誘導HIF-1α上調,抑制化療藥物產生的細胞毒和促凋亡作用,導致耐藥發生。上述研究提示,抑制STAT3/HIF-1α通路的活性將有望改善TNBC化療現狀。蓽茇酰胺(piperlongumine,PL)可抑制不同類型癌細胞增殖并誘導凋亡。研究[4]顯示,PL通過降低STAT3磷酸化抑制TNBC增殖,而對HIF-1α的調控尚不明確。探究PL對STAT3/HIF-1α通路的調控機制,將為PL應用于TNBC的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞來源于西安交通大學第一附屬醫院。

1.1.2實驗動物 12只5周齡SPF級雌性裸鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司,體質量(18.4±0.54)g。生產許可證號:SCXK(京)2019-0008。使用許可證號:SYXK(陜)2022-004。

1.1.3主要藥物與試劑 PL購于美國APExBIO公司;DMEM高糖培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青鏈霉素、Accutase購于美國GIBCO公司;胰蛋白酶購于美國MP公司;MTT試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購于美國Sigma公司;Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購于美國BD公司;BCA蛋白定量試劑盒、特超敏ECL化學發光試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;一抗:增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A/p21)抗體、STAT3抗體、磷酸化信號轉導與轉錄激活因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)抗體、HIF-1α抗體、存活素(Survivin)抗體購于美國CST公司;小鼠抗β-actin一抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗鼠/兔二抗購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.4主要儀器 Epoch酶標儀(美國BioTek公司);Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司);Mini Pro TEAN Tera cell電泳儀、Chemi Doc凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 MDA-MB-231細胞用DMEM高糖培養液(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)培養,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱。細胞密度達70%以上時,用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細胞增殖實驗 取對數期的MDA-MB-231細胞消化接種于96孔板,100 μl/孔過夜培養。藥物分別作用24、48、72 h后再吸出。加MTT工作液100 μl/孔培養4 h后吸出。加DMSO 100 μl/孔振蕩10 min。酶標儀測定各孔490 nm波長處吸光度值(absorbance,A),計算細胞存活率及半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。細胞存活率(%)=A(PL組-空白組)/A(PL 0 μmol/L組-空白組)×100%。

1.2.3細胞凋亡實驗 取對數期的MDA-MB-231細胞消化接種于12孔板,2 ml/孔過夜培養。藥物作用48 h后,用Accutase消化并收集各孔細胞于100 μl緩沖液中。每管分別加5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI,混勻后室溫避光孵育15 min。加400 μl binding buffer,以流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western blot RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度,以等體積loading buffer和不同體積PBS混合至濃度相同。采用SDS-PAGE電泳,濕轉蛋白至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入PCNA、Bcl-2、p21、STAT3、p-STAT3、HIF-1α、Survivin、β-actin抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,PBST漂洗5次。二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h,重復漂洗步驟。加ECL發光液顯色,凝膠成像儀檢測灰度值。

1.2.5裸鼠荷瘤實驗 12只雌性裸鼠飼養于西安醫學院SPF級動物飼養單元。將100 μl MDA-MB-231細胞懸液(5×106個)注射于每只裸鼠的乳腺處。待裸鼠腫瘤體積達到約50 mm3時,將12只裸鼠隨機均分為PBS組和PL組,PBS組6只裸鼠編號為PBS-1至PBS-6,PL組6只裸鼠編號為PL-1至PL-6。隔天經腹腔注射給藥,PBS組注射100 μl PBS,PL組注射100 μl PL溶液(4 mg/kg,溶于PBS)。隔天記錄裸鼠體質量,并以游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑,計算腫瘤體積。腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2。給藥結束后處死所有裸鼠,取出腫瘤稱重,提取腫瘤總蛋白。

2 結果

2.1 PL對MDA-MB-231細胞增殖的影響MTT結果顯示,不同濃度PL處理后,MDA-MB-231細胞存活率逐漸降低。PL作用24、48、72 h的IC50值分別為(17.73± 0.41)、(9.81± 1.21)、(6.77± 1.24)μmol/L,呈現量效和時效關系,見圖1。

圖1 PL對MDA-MB-231細胞增殖的影響(n=3)

2.2 PL對MDA-MB-231細胞凋亡的影響流式細胞術檢測結果顯示,不同濃度PL處理后,MDA-MB-231細胞凋亡率逐漸升高(F= 47.20,P<0.01),且呈量效關系,見圖2。

圖2 PL對MDA-MB-231細胞凋亡的影響(n=3)

2.3 PL對MDA-MB-231細胞增殖與凋亡信號通路的影響Western blot結果顯示,在MDA-MB-231細胞中,PL處理后,PCNA和Bcl-2蛋白表達水平降低(F=24.87,P<0.01;F=17.54,P<0.05),p21蛋白表達水平升高(F=27.74,P<0.01),見圖3。

圖3 PL對MDA-MB-231細胞增殖與凋亡信號通路相關蛋白表達水平的影響(n=3)

2.4 PL對MDA-MB-231細胞STAT3/HIF-1α信號通路的影響Western blot結果顯示,在MDA-MB-231細胞中,PL處理后,p-STAT3、HIF-1α、Survivin 蛋白表達水平降低(F=26.65,P<0.01;F=50.54,P<0.01;F=41.08,P<0.01),STAT3蛋白表達水平無顯著變化(F=1.26,P>0.05),見圖4。

圖4 PL對MDA-MB-231細胞STAT3/HIF-1α信號通路相關蛋白表達水平的影響(n=3)

2.5 PL對裸鼠腫瘤增殖的影響終止給藥后,PBS組和PL組腫瘤體積分別為(867.68± 156.27)mm3和(590.70± 109.76)mm3,腫瘤質量分別為(0.895± 0.236)g和(0.560± 0.124)g。相較于PBS組,PL組腫瘤體積減小(F=12.62,P<0.01),腫瘤質量減輕(F=9.50,P<0.05)。兩組裸鼠體質量間差異無統計學意義(F=0.49,P>0.05),見圖5。

圖5 PL對裸鼠腫瘤增殖的影響(n=1)

2.6 PL對裸鼠腫瘤中STAT3/HIF-1α信號通路的影響終止給藥后,以液氮研磨提取裸鼠腫瘤組織總蛋白,Western blot法檢測PBS組和PL組腫瘤組織中PCNA、p-STAT3、STAT3、HIF-1α、Survivin蛋白的相對表達量。兩組的STAT3蛋白表達水平無顯著變化(F=1.35,P>0.05)。相較于PBS組,PL組的PCNA、p-STAT3、HIF-1α、Survivin蛋白表達水平均降低(F=21.82,P<0.01;F=6.44,P<0.05;F=149.88,P<0.001;F=36.57,P<0.01),見圖6。

圖6 PL對裸鼠腫瘤中STAT3/HIF-1α信號通路的影響(n=1)

3 討論

TNBC在乳腺癌各種類型中惡性程度最高,且化療預后不佳,患者的5年內生存率僅為60%[5]。STAT3是腫瘤早期診斷標志物,與乳腺癌惡變密切相關,其異常活化后調控HIF-1α等信號分子使癌細胞增殖活躍,并導致多臟器轉移和多藥耐藥。PL被報道具有廣泛的抗癌活性,能夠抑制包括TNBC在內的多種腫瘤細胞增殖,而對正常細胞毒性較小。PL的抗癌機制涉及不同信號通路,其是否通過調控STAT3/HIF-1α通路介導對TNBC的抑制增殖和促凋亡作用目前尚不明確。

PL通過調控凋亡相關分子介導腫瘤細胞的凋亡和增殖。Kim et al[6]研究發現,p21通過直接靶向Bcl-2調節癌細胞的侵襲和凋亡。Bcl-2則通過線粒體凋亡途徑控制細胞凋亡,當其表達水平升高時可促進乳腺癌細胞增殖。Chen et al[4]發現,PL通過下調Bcl-2的表達誘導MDA-MB-231細胞凋亡。此外,PCNA與Bcl-2的表達具有相關性,Bcl-2被抑制可導致PCNA表達下調[7]。本研究顯示,PL對MDA-MB-231細胞的抑制增殖和誘導凋亡作用具有濃度依賴性。Western blot結果顯示,PL上調了p21蛋白表達水平,下調了Bcl-2和PCNA蛋白表達水平,提示PL可能通過阻滯細胞周期誘導癌細胞凋亡。此外,裸鼠荷瘤實驗結果表明,PL可在動物體內抑制MDA-MB-231細胞增殖,且未造成動物體質量異常變化。

STAT3/HIF-1α通路異常激活對于腫瘤的發展至關重要。STAT3持續激活促進腫瘤細胞快速增殖,導致缺氧微環境的形成,而HIF-1α是響應缺氧誘導的關鍵轉錄因子,兩者共同介導腫瘤細胞的生物活性調控。STAT3是HIF-1α的原始調控分子,在缺氧條件下發生自身磷酸化[8]。p-STAT3通過激活HIF-1α的啟動子,提高HIF-1α的轉錄和翻譯活性。STAT3/HIF-1α通路異常激活可導致乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲以及抗凋亡能力增強[9]。STAT3/HIF-1α通路還參與腫瘤細胞化療耐藥的形成。Wang et al[10]研究發現,miR-183通過抑制STAT3/HIF-1α通路增強了多藥耐藥肝癌細胞對5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性。值得關注的是,HIF-1α或許發揮了更為關鍵的作用。Shi et al[11]在對多種乳腺癌細胞株的研究中發現,HIF-1α在MDA-MB-231細胞中表達最高,且該細胞在同等培養條件下增殖最快。Xiong et al[12]發現,HIF-1α激活將導致TNBC耐藥以及化療失敗。此外,研究[13]顯示HIF-1α通過調控下游凋亡抑制蛋白Survivin來增強胃癌細胞的抗凋亡能力。在胰腺癌中,聯合阻抑HIF-1α和Survivin產生了比阻抑其一更強的抑制增殖作用[14]。這些研究提示,HIF-1α可能是改善TNBC化療的關鍵因素。此前,PL對癌細胞HIF-1α的影響無明確報道,本研究顯示PL可降低MDA-MB-231細胞HIF-1α的表達水平。隨著PL濃度升高,體外和體內均檢測到p-STAT3蛋白和Survivin蛋白表達水平降低。提示PL很可能通過抑制STAT3和HIF-1α的活性而降低Survivin蛋白表達水平,導致MDA-MB-231細胞增殖能力降低、凋亡率升高。

綜上所述,本研究表明PL在體外和體內抑制MDA-MB-231細胞增殖,其分子機制可能與負調控STAT3/HIF-1α信號通路有關。PL抑制TNBC中HIF-1α表達的調控作用,但仍需在其他類型癌細胞中進行驗證,裸鼠荷瘤實驗還需要在更多劑量下檢測PL的有效性和安全性。在未來的研究中,將選用耐藥TNBC細胞探究PL抗耐藥的機制,為PL應用于TNBC的臨床治療提供更為充分的理論依據。