色氨酸-2, 3-雙加氧酶2在類風濕關節炎患者外周血單個核細胞和滑膜組織中的表達及意義

陳阿圓,許 媛,許和鵬,魏 偉,常 艷

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性疾病,其特征是關節腫脹、壓痛和滑膜關節破壞。犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)通路為色氨酸(tryptophan, Trp)代謝的主要途徑,與自身免疫病發病密切關聯[1]。研究[2-3]表明,RA患者血清和關節滑液中Kyn水平升高,且與患者疾病活動性和炎癥指標相關。

色氨酸2,3-雙加氧酶2(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2)作為Kyn通路的主要限速酶,對Trp催化具有高度專一性。TDO2主要在肝臟和大腦中表達,本課題組前期研究[4]顯示TDO2在T細胞、B細胞和巨噬細胞等免疫細胞中表達。近年來,TDO2作為神經精神疾病、癌癥和自身免疫病治療的可能性潛在靶點引起了越來越多的關注[5],但目前TDO2在RA中的表達和作用研究未見報道。本課題組前期研究表明,抑制TDO2可緩解佐劑性關節炎大鼠滑膜炎癥和關節破壞[6],可能與TDO2介導成纖維樣滑膜細胞異?；罨嘘P。然而,在RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)和滑膜組織中TDO2的表達以及臨床意義尚不明確。該研究采用流式細胞術和免疫熒光法檢測TDO2在RA患者和健康人PBMC以及滑膜組織中的表達,對RA患者PBMC中TDO2表達與其炎癥指標之間進行相關性分析,為初步探索TDO2在RA中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2021年4月—2022年4月安徽醫科大學第一附屬醫院診治的40例RA患者,年齡36～77(57.8±9.0)歲,男12例,女28例。RA組患者均符合2010年美國風濕病學會制定的RA診斷標準[7],并排除其他自身免疫病、腫瘤等嚴重性疾病。正常對照組均為健康人,共36例,年齡23～75(53.4±10.9)歲,男14例,女22例,排除存在感染、腫瘤和其他免疫性疾病。正常對照組和RA組之間年齡和性別差異均無統計學意義。收集RA組相關實驗室數據類風濕因子 (rheumatoid factor, RF),C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、抗環瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrulline peptide,anti-CCP)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)。本課題由安徽醫科大學倫理委員會批準(批準號:20210085)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑 Ficoll-Hypaque人淋巴細胞分離液購于上海達科為生物技術有限公司,固定液(Fixation/Perm Diluent 和 Fixation/Permeabilization Concentrate)和破膜液(Permeabilization Buffer 10×)購于美國Invitrogen公司;人源TDO2-APC 流式抗體購于美國R&D公司;TDO2(15880-I-AP)抗體購于中國武漢三鷹生物技術有限公司;DAPI溶液和抗熒光衰減封片劑購自中國北京索萊寶公司;山羊抗兔IgGAF594購于中國上海Abmart醫藥科技有限公司。

1.2.2主要儀器 十色流式細胞儀(型號:Waters XEVO, TQ-S MS/MS)購于美國貝克曼公司;激光共聚焦顯微鏡(型號:Leica sp8)購于德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1人PBMC的標本采集與處理 用冰盒保存EDTA抗凝管收取的正常對照組和RA組外周血樣本,4 h內用Ficoll-Hypaque人淋巴細胞分離液分離提取正常對照組和RA組的PBMC。

1.3.2流式細胞術檢測PBMC中TDO2表達 顯微鏡下觀察提取的正常對照組和RA組PBMC細胞形態,調整細胞密度為2×106,重懸于100 μl磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)中。每管加入100 μl固定液,室溫避光孵育15 min。用PBS洗滌后,加入破膜液95 μl,室溫避光孵育10 min后,加入5 μl人源TDO2-APC流式抗體,4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌并重懸后,過200目紗網轉移至流式管中上機檢測并分析TDO2表達比例和平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)。

1.3.3免疫熒光法檢測滑膜組織中TDO2表達 將取得的正常對照組和RA組滑膜組織固定、包埋和切片后,進行脫蠟水化。4 ℃孵育一抗TDO2(1 ∶200)過夜。次日室溫避光孵育熒光二抗(山羊抗兔IgGAF594,1 ∶200)2 h,PBS洗滌3次后,室溫避光孵育DAPI 8 min。PBS洗滌3次,用抗熒光淬滅劑進行封片,激光共聚焦顯微鏡進行拍片。

1.3.4Image J分析滑膜組織中TDO2 MFI 在免疫熒光染色中,單通道(單色)的熒光圖片每個像素的灰度值代表了該點的熒光強度大小,特定區域的熒光強度公式:平均熒光強度(mean gray value, Mean)=該區域熒光強度總和(integrated density, IntDen)/該區域面積(Area)。在Image J中打開拍攝好的圖片,圖片格式設置成8-bit,提取單一通道,調整圖片閾值,控制每張圖片的閾值在統一的范圍內,并選擇合適的閾值算法。設定檢測參數Mean、InDen、Area,最后分析Mean值,即TDO2 MFI。

1.4 統計學處理采用SPSS 21.0軟件進行數據分析,結果均用Mean±SEM表示。兩組數據采用獨立樣本t檢驗比較組間差異,采用Pearson和Spearman進行相關性分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TDO2在RA患者PBMC中的表達流式細胞術檢測結果表明,與正常對照組相比,RA組PBMC中TDO2表達水平顯著升高,TDO2 MFI與正常對照組相比,差異有統計學意義(t=-3.920,P<0.001),見圖1。

圖1 RA患者PBMC中TDO2的表達

2.2 TDO2在RA患者滑膜組織中的表達在RA疾病進程中,滑膜組織生理學功能被破壞,轉化為增生性侵襲組織。此外,滑膜組織中成纖維樣滑膜細胞功能異常和免疫細胞(T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)浸潤,導致軟骨和骨骼的破壞。免疫熒光結果顯示,TDO2在RA組滑膜組織中表達增加,MFI顯著高于正常對照組,差異有統計學意義(t=-3.600,P<0.001),見圖2。

圖2 兩組滑膜組織中TDO2的表達 ×630

2.3 RA患者PBMC中TDO2表達與炎癥指標的關系為了研究TDO2表達與患者炎癥指標之間的關系,對RA患者PBMC中TDO2表達與ESR、RF、CRP和anti-CCP之間進行了相關性分析。Pearson分析結果顯示,RA組PBMC中TDO2表達與ESR呈正相關(r=0.405,P=0.045),見圖3A。而Spearman分析結果顯示,RA組PBMC中TDO2表達與RF、CRP和anti-CCP無顯著相關性(rs=0.359,P=0.078;rs=0.093,P=0.658;rs=-0.289,P=0.162),見圖3B-3D。

圖3 RA患者PBMC中TDO2表達與炎癥指標的相關性分析(n=25)

3 討論

RA作為一種慢性自身免疫病,其臨床表現主要為晨僵/關節痛與壓痛/關節腫脹。慢性滑膜炎癥作為RA的主要病理特征,在晚期治療不足的情況下,最終形成軟骨破壞和骨侵蝕,從而出現關節畸形。Kyn通路作為Trp代謝的主要代謝途徑,在RA疾病進程中可能發揮重要作用。研究[8]表明,在RA患者關節滑液和尿液中Kyn水平升高,提示Kyn通路在RA患者體內代謝異常。Kyn通路在三種同工酶吲哚胺2,3雙加氧酶1(indoleamine-2,3-dioxygenase1, IDO1)、IDO2和TDO2的催化下,將Trp轉化生成Kyn。IDO1廣泛表達于組織、器官和細胞中,除Trp外,IDO1還可催化多種含吲哚結構的底物。IDO2作為IDO1同源類似物(43%的同源性),主要表達于腎臟、大腦和附睪[9]。在RA疾病進程中,IDO1的作用存在爭議,它既有促炎表現[10],也有抗炎作用[11]。IDO2在RA中的研究較少,近年來研究[12]顯示在RA中具有促炎作用。

Lanz et al[13]發現在實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠中,肝臟TDO2表達和活性增加,從而激活脊髓神經元的興奮性毒性受體,致使神經變性和脫髓鞘。TDO2缺失的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠焦慮相關行為和神經變性癥狀減輕,表明TDO2可能參與了自身免疫病疾病進程。課題組前期研究發現,TDO2不僅在佐劑性關節炎大鼠的CD4+T細胞、B細胞和成纖維樣滑膜細胞中表達增加,并且抑制TDO2的表達可抑制佐劑性關節炎大鼠成纖維樣滑膜細胞的增殖、遷移和侵襲能力[6,14],改善滑膜炎癥和關節破壞,提示TDO2在RA機制中可能是一個新的關鍵調節因子。為進一步了解TDO2與RA之間的關系,本研究探討了TDO2在RA患者外周血和滑膜組織中的表達以及與炎癥指標是否具有相關性。

本研究從臨床角度出發,檢測RA患者和健康人PBMC中TDO2的表達,結果顯示RA患者PBMC中TDO2表達顯著高于正常對照組,提示TDO2介導的Kyn代謝通路可能參與了RA炎癥免疫反應。此外,在對RA患者PBMC中TDO2表達與炎癥指標相關性分析結果中發現,RA患者PBMC中TDO2表達與炎癥指標ESR呈正相關。滑膜組織主要由襯里層和襯里下層組成。在RA中,成纖維樣滑膜細胞功能異常致使襯里層擴張增生,大量免疫細胞如T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞募集在襯里下層浸潤,產生大量促炎因子,最終導致持續性滑膜炎癥和軟骨、骨侵蝕[15]。免疫熒光結果顯示,TDO2在RA患者滑膜組織中表達增加,提示TDO2可能通過調控成纖維樣滑膜細胞和免疫細胞異?；罨?促進慢性滑膜炎癥。

綜上所述,在關節損傷過程中,TDO2可能參與了RA的病理機制,介導持續性滑膜炎癥生成。TDO2介導的Kyn通路在RA中發生代謝失衡,并參與炎癥免疫反應進而促進RA進展。