體外培養外周血來源NK細胞純度影響因素及其預測模型的構建

葛 瑤,王春燕,劉 琦,郭 靜,熊 兵,劉淑鵬,程忠平

自然殺傷(natural killer,NK)細胞是一群CD3-CD56+的先天免疫淋巴細胞,可以快速識別并殺傷病變細胞[1]。近幾年國內外關于NK細胞回輸所開展的臨床實驗有很多,研究的疾病主要包括血液系統腫瘤和實體瘤[2]。用于臨床回輸的NK細胞來源廣泛,包括外周血來源、臍帶血來源和細胞系來源的NK細胞[3]。其中,外周血來源的NK細胞獲取簡單,操作方便。外周血來源的NK細胞培養方法主要有飼養層培養法和因子激活法。其中,飼養層培養法雖然其擴增NK細胞的作用十分顯著,但是K562細胞作為異源性細胞,存在一定的輸入安全隱患[4]。因子激活培養法是通過使用含有白細胞介素(interleukin, IL)-2等細胞因子的培養基激活擴增NK細胞,安全性較高,但此NK細胞純度存在較大的個體差異,嚴重影響后續治療效果[5]。為了對體外培養的NK細胞純度進行預測,該研究探討了影響NK細胞體外培養純度的相關因素,構建一種預測NK細胞純度的模型,為后續臨床診療方案的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 捐獻者資料收集2020年1月—2022年3月在上海市第十人民醫院門診部體檢并同意捐贈外周血用于NK細胞體外培養的93例健康人群的信息,其中男性23例,女性67例;年齡20～73(52±9.16)歲。本研究中93例健康捐獻者無家族病史以及無傳染病、心腦血管疾病、肝腎疾病或免疫學疾病,同時剔除其他相關人群,如吸煙、酗酒、藥物濫用史、懷孕。本研究經上海市第十人民醫院醫學倫理委員會批準(批號:20K180),患者簽署知情同意書。

1.2 NK細胞的體外培養及純度檢測按照藥品生產質量管理規范(good manufacturing practice of medical products, GMP)要求,抽取捐獻者40～50 ml的外周血,通過密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞和血漿,使用添加100 IU/ml激活因子的培養基和10%的自體血漿重懸細胞(細胞原始密度為2×106/ml)。培養第0～7天,使用添加激活因子的培養液激活細胞;培養第8～14天使用添加200 IU/ml IL-2的擴增培養液擴增細胞。培養第14天時,采用流式細胞術檢測免疫分子CD3、CD56的表達情況。通過檢測CD3-CD56+的細胞占總細胞數的百分比,分析NK細胞純度。

1.3 臨床指標收集捐獻者外周血采樣前的檢查數據,共138項指標。① 血常規指標包括:紅細胞(red blood cell,RBC)、血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞平均體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、紅細胞分布寬度(red blood cell distribution width,RDW)、紅細胞分布寬度標準差(standard deviation of red blood cell volume distribution width,RDW-SD)、白細胞計數、中性粒細胞數、中性粒細胞百分比、淋巴細胞數、淋巴細胞百分比(percentage of lymphocytes,LY%)、嗜酸粒細胞百分比(percentage of eosinophils,EOS%)、嗜堿粒細胞百分比、嗜酸粒細胞數(number of eosinophils,EOS)、嗜堿粒細胞數、單核細胞百分比、單核細胞數、血小板計數、血小板平均體積、血小板壓積、血小板分布寬度(width of platelet volume distribution, PDW)。② 生化指標包括:丙氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、球蛋白、葡萄糖(glucose, Glu)、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、鉀、鈉、氯、三酰甘油、尿酸、尿素氮、肌酐(creatinine, Cr)。③ 其他指標包括:凝血功能指標、淋巴細胞亞群(T細胞、B細胞和NK細胞)、甲狀腺功能指標、免疫抗體指標和腫瘤標志物指標。

1.4 統計學處理將93例捐獻者的體檢指標及NK細胞純度信息隨機排列,抽取77例作為訓練集,16例作為測試集。對訓練集中138項臨床檢測指標進行統計,按照缺失值占比超過0.4的原則進行刪除。使用Pearson相關性檢驗,將剩余的63項臨床指標納入單因素分析,篩選出影響NK細胞純度的變量。多因素分析采用step AIC函數進行逐步回歸,篩得變量重新建立回歸模型。在測試集中,分析NK index模型預測純度與真實純度的相關性;再對訓練集中的自變量進行二分類處理,以NK細胞實際純度的中位值為截斷點,分高低兩組,分析訓練集和測試集受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)下面積(area under the curve,AUC)。數據采用R語言、Prism 8.0和Excel軟件進行分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NK細胞純度分布NK細胞純度流式檢測結果顯示,93例健康捐獻者中,2例捐獻者NK的細胞純度在0.8以上,17例捐獻者NK細胞的純度分布在0.6～0.8,36例捐獻者NK細胞的純度在0.4～0.6之間,26例捐獻者NK細胞的純度分布在0.2～0.4之間,12例捐贈者NK細胞的純度小于0.2。以上結果說明在相同的因子誘導條件下,NK的細胞純度存在個體間的差異。

2.2 影響NK細胞純度的單因素分析單因素分析結果顯示,年齡、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW與NK細胞體外培養純度存在統計學意義(P<0.05),見表1。散點圖(圖1)進一步分析了年齡、T3、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW與NK細胞純度之間的線性關系,除了LY%與NK細胞純度之間存在負相關線性關系,其他指標均與NK細胞存在正相關線性關系。

圖1 臨床檢測指標與NK細胞純度的線性關系圖

表1 影響NK細胞純度的臨床檢測指標單因素分析

2.3 影響NK細胞純度的多因素分析及預測模型的建立多因素變量回歸分析顯示,RDW-SD(P<0.001)、PDW(P<0.001)、Glu(P<0.001)和T3(P<0.1 )為影響NK細胞純度的關鍵變量,并以這4個變量重新建立回歸模型,最終建立預測模型NK index=-164.557+2.544×RDW-SD +3.730×PDW+4.389×Glu+10.237×T3(R2=0.494,P<0.05)。

2.4 NK index模型預測值與實際值的相關分析在測試集中,對NK index模型的預測純度與真實純度做線性相關分析(R=0.725,P=0.001),說明NK index模型預測純度與真實純度之間存在較強的統計學意義。見圖2。

圖2 NK index 模型預測值與真實值的線性關系圖

2.5 NK index模型在訓練集和測試集中ROC曲線分析利用AUC分析NK index模型對于NK細胞純度高低的預測能力。結果顯示,訓練集中NK index模型的AUC為0.815(95%CI=0.753～0.915),見圖3;測試集中NK index模型的AUC為0.938(95%CI=0.82.41～1.00),見圖4,說明NK index模型對NK細胞純度高低有較好的預測價值。

圖3 訓練集中NK index模型的ROC曲線

圖4 測試集中 NK index模型的ROC曲線

3 討論

在NK細胞的臨床回輸中,通常需要在體外擴增出大量高純度的NK細胞。使用因子誘導法培養NK細胞時,NK細胞的純度和數量總是存在較大的個體間差異。通過收集捐獻者的外周血進行14 d的體外因子刺激培養,統計結果顯示NK細胞純度在個體間差異較大。為了找到影響NK細胞純度的指標,該研究收集了常見的臨床指標,通過對納入的68項臨床指標進行單因素分析,結果顯示,年齡、T3、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW與NK細胞純度有相關性。研究[6]表明,年齡的增加會降低固有免疫系統功能,但同時也會增加疾病的易感性。與成人相比,老年人的促炎細胞因子、腫瘤壞死因子和IL-6更高,NK細胞的數量也呈現出增加的趨勢。本研究顯示,年齡的增加也會提高NK細胞純度,說明年齡的增加可以促進促炎因子的升高,進而增加NK細胞純度。T3為主要發揮生物活性的甲狀腺激素,在固有免疫系統中具有促炎作用,可以促進NK細胞的增殖和活性[7]。本研究顯示T3在數值較高時,對應的NK細胞純度值也較大,說明甲狀腺原氨酸可能會促進NK細胞相關受體的活化與表達。RDW為紅細胞大小的變異系數,RDW-SD為紅細胞分布曲線寬度的實際測量值,兩者被廣泛應用于炎癥性疾病的臨床檢驗,與炎癥標志物密切相關,如C反應蛋白、IL-6和腫瘤壞死因子。目前很多學者提出RDW可以作為預測多種疾病的參數,RDW越高,預后越差[8]。Lochowski et al[9]研究提示,RDW-SD>43時,可以作為非小細胞肺癌預后不良的獨立因素。在本研究中,RDW和RDW-SD與NK細胞純度呈現正相關,提示RDW和RDW-SD的升高會促進體內炎性因子的升高,進而促進NK細胞數量和純度的提高。血清Cr作為最常用的腎臟功能的生物學標志物,用來評估慢性腎病[10]。研究[11]表明,在慢性腎病的研究中,輕度尿毒癥患者可以通過增加NK細胞的百分比來影響NK細胞的功能。本研究顯示Cr與NK細胞純度呈現正向相關性,提示Cr作為NK細胞純度的預測因素可能具有重要意義。Glu是一種關鍵的細胞燃料, 通過分解可以產生能量分子,促進NK細胞的增殖和代謝[12],因此推測Glu通過產生能量分子,進而提高NK細胞純度。PDW被定義為血小板大小異質性的指標, 作為血栓炎癥條件的風險預測因子的有效性[13],可能會促進NK細胞的增殖和活性作用,在本研究結果中,PDW可能通過促進NK細胞的增殖和活性,進而提高NK細胞的純度。淋巴細胞和嗜酸性粒細胞都屬于白細胞的一部分。研究[14]表明LY%的高低與病情嚴重程度相關,通常認為人體抵御外來病毒的侵襲主要依賴T淋巴細胞介導的細胞免疫作用,說明LY%的升高可能主要與T淋巴細胞的激活有關。在本研究結果中,LY%與NK細胞純度數值呈負相關,說明T淋巴細胞的大量激活可能會抑制NK細胞的體外增殖。有研究[15]表明嗜酸粒細胞主要合成、儲存和分泌細胞因子、趨化因子和生長因子,說明嗜酸粒細胞可能促進NK細胞的激活和擴增。在本研究結果中,嗜酸粒細胞與NK細胞純度呈正相關,推測嗜酸粒細胞可能促進NK細胞的激活和擴增來提高NK細胞純度。

通過對多因素變量的分析,篩選出RDW-SD、PDW、Glu和T3作為NK細胞純度的預測因素,最終建立了能夠較好預測NK細胞純度的NK index模型。對于純度不能達到臨床回輸要求的個體,可以提前告知患者,從而大大縮減了培養的成本。因此,獲取臨床可用的、簡便有效的指標構建NK細胞純度預測模型具有潛在的科研和社會應用價值。

本研究通過收集常見的臨床指標來分析影響NK細胞純度的因素,但由于該模型還存在一些不足:由于缺少免疫相關的指標,如IgM、IgG、干擾素和腫瘤壞死因子等。本研究對捐獻者的免疫狀態描述不夠全面,后續可進一步探索以免疫學指標為變量所構建模型的預測價值。因此,需要進一步擴大樣本量和臨床檢測指標進行研究,以得到更理想的預測模型。