促血管和血管擬態(tài)生成因子VEGFA、MMP-14在肺腺癌中的表達及臨床意義

李 輝,黃俊峰,周 靜,周廷棟,陳禮文

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構發(fā)布的全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示,2020年中國肺癌新發(fā)病例82萬例,占新發(fā)癌癥的17.9%,肺癌死亡71萬例,占癌癥死亡總數(shù)的23.8%,均遠遠高于其他癌癥占比,其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)為最常見的病理類型[1]。LUAD的高侵襲和轉移是導致預后不良的主要原因,嚴重危害人類健康[2]。

腫瘤的生長、侵襲、轉移與經(jīng)典血管形成(毛細血管芽生方式)和血管擬態(tài)形成有密切聯(lián)系[3-4]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGFA)和基質金屬蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)分別參與芽生血管形成和血管擬態(tài)生成[5-6]。關于芽生血管形成和血管擬態(tài)在LUAD中的作用目前尚未闡明,該研究通過檢測LUAD患者外周血VEGFA和MMP-14水平及其與LUAD患者臨床病理特征的相關性,探討兩類血管生成方式在LUAD生長、侵襲與轉移中的作用與臨床意義,并利用生物信息分析數(shù)據(jù)庫分析其表達情況及與生存預后的關系,為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源采用UALCAN(ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)數(shù)據(jù)庫分析LUAD MMP-14和VEGFA蛋白表達,TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov)數(shù)據(jù)庫分析LUAD MMP-14和VEGFA mRNA表達及其與生存預后相關性。

1.2 研究對象收集安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院2022年1—7月收治的69例患者(所有患者為經(jīng)病理證實的初診患者)的血清和臨床資料,其中男44例,女25例,年齡53～85歲,平均年齡(66.88±8.96)歲。其中LUAD早期患者(Ⅰ+Ⅱ期)11例,LUAD晚期患者(Ⅲ+Ⅳ期)58例。選擇同期20例健康個體為對照組,其中男12例,女8例,年齡54～75歲,平均年齡(65.85±7.10)歲。納入標準:所有患者均根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學、病理及實驗室檢查確診;對照組在安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院體檢中心進行體檢,結果正常,患者無其他類型腫瘤,無心、肝、腎等重要器官疾病。實驗經(jīng)過受試者知情同意并經(jīng)安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(編號:YX2022014)。

1.3 儀器與試劑MMP-14試劑盒購于美國Omnimabs公司,VEGFA試劑購于威海威高生物科技有限公司,配套威海威高JR-1半自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)試劑盒及校準品購于美國雅培公司,配套雅培化學發(fā)光免疫分析儀Alinity i。

1.4 方法收集研究對象空腹靜脈血,3 500 r/min離心5 min后分裝在一次性EP管,-80 ℃保存。實驗前,先將試劑盒置于室溫(18～25 ℃)30 min,嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作。ELISA法檢測樣本血清中MMP-14水平,使用酶標儀在450 nm波長處定量檢測。化學發(fā)光法檢測樣本血清中VEGFA水平,若有樣本結果大于檢測上限,則用樣本稀釋液稀釋10倍后重測。

2 結果

2.1 LUAD組織MMP-14和VEGFA蛋白表達情況UALCAN數(shù)據(jù)庫中分析LUAD組織MMP-14和VEGFA蛋白表達情況,結果顯示,原發(fā)性LUAD患者腫瘤組織中MMP-14和VEGFA蛋白水平均高于對照組(P<0.001),見圖1。

圖1 LUAD組織MMP-14和VEGFA蛋白表達情況

2.2 LUAD患者血清MMP-14和VEGFA表達水平LUAD早期組、晚期組和對照組在性別、年齡、吸煙史間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。三組受試者血清MMP-14(Z=16.207,P<0.001)及VEGFA(Z=25.494,P<0.001)表達水平之間差異均有統(tǒng)計學意義。血清MMP-14表達水平在LUAD早期組高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.684,P=0.006),LUAD晚期組略高于LUAD早期組,但差異無統(tǒng)計學意義(Z=-0.820,P=0.412);血清VEGFA表達水平在LUAD早期組高于對照組(Z=-2.271,P=0.023),且LUAD晚期組高于LUAD早期組(Z=-2.082,P=0.037),差異均有統(tǒng)計學意義。見表1、圖2。

表1 受試者基本信息及血清MMP-14、VEGFA表達水平比較

圖2 LUAD晚期組、LUAD早期組及對照組血清MMP-14、VEGFA表達水平A:受試者血清MMP-14水平比較;B:受試者血清VEGFA水平比較;與對照組比較:*P<0.05;與LUAD早期組比較:#P<0.05

2.3 MMP-14和VEGFA表達水平與LUAD臨床病理特征相關性LUAD患者血清MMP-14水平在T3/T4期水平高于T1/T2期(Z=-2.002,P=0.045),N2/N3期高于N0/N1期(Z=-2.106,P=0.035),胸膜轉移組高于未轉移組(Z=-2.118,P=0.034),差異均有統(tǒng)計學意義,在臨床分期和M分期中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);VEGFA水平在M1期高于M0期(Z=-2.234,P=0.025),在臨床Ⅲ+Ⅳ期水平高于Ⅰ+Ⅱ期(Z=-2.082,P=0.037),在T和N分期中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);血清MMP-14和VEGFA表達水平在不同性別、年齡、吸煙史、骨轉移及腦轉移組之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

2.4 VEGFA和MMP-14對LUAD的預測分析納入性別、年齡、VEGFA和MMP-14指標構建多因素Logistic回歸方程,結果顯示,VEGFA水平升高將增加患LUAD的風險,MMP-14水平升高也將增加患LUAD的風險,但無統(tǒng)計學意義(OR=1.387,95%CI0.579～3.324,P=0.463);相對男性,女性不會增加LUAD發(fā)生的風險(OR=0.459,95%CI0.138～1.525,P=0.203);年齡的增長也不增加LUAD發(fā)生的風險(OR=0.980,95%CI0.909～1.057,P=0.608)。見表3。

表3 相關參數(shù)多因素Logistic回歸分析結果

2.5 MMP-14、VEGFA單項或聯(lián)合CEA對LUAD的診斷效能評估以對照組為參考,ROC分析顯示,MMP-14、VEGFA和CEA單項診斷LUAD的曲線下面積(AUC)分別為0.793、0.849、0.851,95%CI分別為0.694～0.872,0.757～0.916,0.760～0.918,三者AUC之間兩兩比較,差異均無統(tǒng)計學意義;兩項聯(lián)合(MMP-14+VEGFA)及三項聯(lián)合(MMP-14+VEGFA+CEA)檢測AUC分別為0.893、0.952,95%CI分別為0.810～0.949、0.885～0.986,三項聯(lián)合檢測AUC均高于三項單項檢測及兩項聯(lián)合,差異均有統(tǒng)計學意義。兩項聯(lián)合檢測AUC高于三項單項檢測,但差異無統(tǒng)計學意義。MMP-14、VEGFA、CEA、兩項聯(lián)合及三項聯(lián)合檢測診斷LUAD的最佳診斷界值分別為1.06 ng/ml、0.49 μg/ml、6.79 ng/ml、0.59及0.52,此時具有最佳診斷效能。見表4、5及圖3。

表4 MMP-14和VEGFA單項和聯(lián)合檢測對LUAD的診斷效能

圖3 MMP-14和VEGFA單項及聯(lián)合檢測診斷LUAD的ROC曲線兩項聯(lián)合:MMP-14+VEGFA;三項聯(lián)合:MMP-14+VEGFA+CEA

2.6 MMP-14和VEGFA mRNA表達水平與LUAD患者預后的關系通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析MMP-14和VEGFA mRNA表達水平與LUAD患者生存預后的關系,以表達水平低于中位數(shù)的為低表達組,高于中位數(shù)的為高表達組。結果提示MMP-14和VEGFA mRNA高表達組的OS與DSS均低于低表達組(P<0.05),見圖4。

表5 單項或聯(lián)合檢測診斷LUAD的ROC-AUC之間比較

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫分析MMP-14和VEGFA表達水平與LUAD患者OS和DSS的關系

3 討論

通過生物信息分析大樣本數(shù)據(jù)提示,LUAD患者腫瘤組織MMP-14和VEGFA 蛋白表達水平高于正常肺組織,體外血清試驗也顯示,LUAD患者血清MMP-14和VEGFA水平均高于對照組,Pietrzak et al[7]研究也顯示,MMP-14在NSCLC患者的組織和血液表達水平均高于正常對照組。既往研究[8]顯示,VEGFA在包括肺癌在內多種腫瘤中高表達,但也有研究[9]顯示,正常肺組織中也高表達VEGFA。

新生血管形成在腫瘤生長和轉移過程中起著決定性作用。腫瘤新生血管形成包括經(jīng)典的內皮性血管芽生和血管擬態(tài)兩種方式,VEGFA促進經(jīng)典血管芽生,而MMP-14可促進腫瘤組織血管擬態(tài)形成,降解細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蛋白并增強細胞遷移,從而促進腫瘤的侵襲性。本研究顯示,LUAD早期和晚期組患者血清VEGFA和MMP-14表達水平均高于對照組。血清VEGFA表達水平在LUAD晚期組高于LUAD早期組,而MMP-14水平在LUAD早期和晚期患者之間差異無統(tǒng)計學意義,提示VEGFA和MMP-14在LUAD發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。因此,推測經(jīng)典的芽生式血管形成在LUAD的發(fā)生、發(fā)展及遠端轉移過程中發(fā)揮關鍵作用,而血管擬態(tài)更多地與LUAD生長及其向周圍侵襲有關。

進一步研究顯示,LUAD患者血清MMP-14水平在T3/T4期水平高于T1/T2期,N2/N3期高于N0/N1期,胸膜轉移組高于未轉移組,在臨床分期和M分期中差異無統(tǒng)計學意義;VEGFA水平在M1期高于M0期,在T和N分期中差異無統(tǒng)計學意義。這些結果進一步驗證了推測,即MMP-14可能與LUAD的生長及其向臨近組織和淋巴侵襲有關,而腫瘤的遠端轉移更多與VEGFA有關。Xu et al[10]研究也表明非小細胞肺癌患者血清VEGFA水平高于對照組,但Liu et al[11]研究結果顯示,VEGFA在非小細胞肺癌組織中的表達與腫瘤大小、惡性分化程度、TNM分期以及淋巴結轉移呈正相關,筆者分析結果差異的原因可能與研究對象的差異有關,該研究以非小細胞肺癌整體作為對象,而本研究對象僅為LUAD。另外,MMP-14在LUAD組織中的表達高于正常組織[12],Yu et al[13]研究顯示MMP-14表達與大腸癌的腫瘤分期相關,而關于MMP-14與LUAD的分期或轉移的關系研究較少。因此,需要進一步研究探討MMP-14在LUAD生長、侵襲和轉移中的作用及其分子與細胞機制。

本研究納入性別、年齡、VEGFA和MMP-14等指標構建多因素Logistic回歸方程表明,MMP-14和VEGFA表達水平在不同性別、年齡、吸煙史、骨轉移及腦轉移組之間差異均無統(tǒng)計學意義。但是,VEGFA水平升高將增加患LUAD的風險(OR=7.517,P=0.002);MMP-14水平升高也將增加患LUAD的風險,但差異無統(tǒng)計學意義(OR=1.387,P=0.463)。這些結果提示血清VEGFA和MMP-14具有作為分子標記診斷LUAD的潛力。需要注意的是,本研究為小樣本研究,因此在后續(xù)研究中需要進一步擴大樣本量以驗證MMP-14在LUAD中的風險評估價值。

本研究中ROC分析顯示,血清VEGFA和MMP-14對LUAD均有一定診斷價值,AUC分別為0.849、0.793,與傳統(tǒng)腫瘤標志物CEA診斷LUAD的AUC(0.851)相近,但三者之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義。兩項聯(lián)合(MMP-14+VEGFA)及三項聯(lián)合(MMP-14+VEGFA+CEA)檢測AUC分別為0.893、0.952,兩項或三項聯(lián)合檢測均可提高其對LUAD的診斷效能,但三項聯(lián)合檢測診斷效能最高,可提高診斷敏感性,且與單項檢測和兩項聯(lián)合比較,差異均有統(tǒng)計學意義。兩項聯(lián)合檢測與單項檢測的AUC差異無統(tǒng)計學意義。研究還顯示MMP-14、VEGFA、CEA診斷LUAD的最佳診斷界值分別為1.06 ng/ml、0.49 μg/ml、6.79 ng/ml,此時具有最佳診斷效能。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析了LUAD患者MMP-14和VEGFA表達水平與生存預后的關系,結果顯示MMP-14和VEGFA高表達組的OS與DSS均低于低表達組(P<0.05)。 Pietrzak et al[7]研究顯示MMP-14表達高于中位數(shù)的患者的OS明顯短于MMP-14表達低于中位數(shù)的患者,體外血清實驗也顯示MMP-14在T和N分期較晚的患者水平較高,說明MMP-14用于肺癌臨床預后評估有一定意義。

綜上所述,LUAD患者VEGFA和MMP-14水平異常高表達,VEGFA可能與LUAD遠端轉移有關,MMP-14可能與LUAD腫瘤生長、臨近組織和淋巴侵襲相關。血清VEGFA水平升高對LUAD有較高預測價值,MMP-14和VEGFA對LUAD均有一定診斷價值,且聯(lián)合CEA檢測后可提高診斷LUAD的效能,生物信息分析提示MMP-14和VEGFA水平對LUAD生存預后有一定意義。