miR-381-3p在急性髓系白血病中的表達(dá)及對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張紅霞,王 奎,吳廣勝

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一種累積遺傳突變所導(dǎo)致的常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1],發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中居第13位和第9位[2]。AML常導(dǎo)致出血、致命感染或器官侵犯[3]。臨床上對(duì)AML的治療通過多藥聯(lián)合化療及造血干細(xì)胞移植,但5年總生存率仍低于30%[4]。因此,有必要尋找新的生物標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷和治療指導(dǎo)。

微小RNA (microRNAs,miRNAs)是一種含有約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA分子,通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′-UTR)結(jié)合,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平靶基因的表達(dá),翻譯抑制或mRNA降解參與基因沉默[5]。在AML的發(fā)生發(fā)展中,miRNA通過多種方式最終失調(diào)miRNA導(dǎo)致疾病的發(fā)生[6]。因其高度的保守性、穩(wěn)定性以及廣泛存在于組織和血液中[7],miRNAs作為多種疾病的臨床診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物已被廣泛研究[8]。該研究旨在探討血清miR-381在AML中的表達(dá)、臨床價(jià)值及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用,旨在為治療AML的臨床診斷和預(yù)后提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 AML患者的納入收集2014年6月—2016年10月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診及新住院確診但未經(jīng)系統(tǒng)治療的AML患者90例作為實(shí)驗(yàn)組(AML組),男62例,女28例,16～85歲,中位年齡49歲,其中<60歲39例,≥60歲51例;骨髓原始細(xì)胞<60%的16例,≥60%的17例;染色體異常57例。所有患者均符合FAB國際分型診斷標(biāo)準(zhǔn),按照FAB分類:M0型3例,M1型6例,M2型30例,M3型5例,M4型2例,M5型41例,M6型3例。同時(shí),選取健康骨髓捐贈(zèng)者30例作為對(duì)照組(正常組),其中男17例,女13例。本研究通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào):A2021-074-01),入組患者均知情同意,臨床資料均從門診和住院病歷資料中獲取。骨髓穿刺術(shù)在無菌條件下進(jìn)行,留取3～5 ml骨髓液,EDTA抗凝管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 miRNA和總RNA的提取按照miRNA和總RNA提取試劑盒的方法提取單個(gè)核細(xì)胞中miRNA和總RNA,利用Taqman MicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以U6內(nèi)參按照Taqman miRNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),得到數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理,計(jì)算miR-381-3p的表達(dá)量。

1.3 miR-381的表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系收集納入研究對(duì)象的年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞、FAB分型等,對(duì)患者進(jìn)行長期隨訪了解無病生存期(disease-free survival,DFS)、總生存期(overall survival,OS),分析miR-381表達(dá)的高低與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)液氮罐中取出凍存管中AML細(xì)胞于水浴鍋中融化,后移至離心機(jī)中以800 r/min進(jìn)行離心,沉淀細(xì)胞使用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基重懸后再次離心,后得到沉淀細(xì)胞,再次用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞到達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行傳代,使用1 ml胰蛋白酶消化細(xì)胞,再用DMEM培養(yǎng)基終止消化過程,后離心得到沉淀培養(yǎng)基重懸后按照1 ∶3比例接種至新的培養(yǎng)瓶中;取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞離心后取沉淀細(xì)胞,使用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞,放置入細(xì)胞凍存盒中置于-80 ℃冰箱中,次日移至液氮罐中進(jìn)行凍存。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染miR-381-3p后,分為過表達(dá)組miR-381-3p mimics、敲低組miR-381-3p inhibitor以及各自對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照。待轉(zhuǎn)染入24 h進(jìn)行換液處理,48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),具體序列見表1。

表1 質(zhì)粒序列

1.6 qRT-PCR按照miRNA提取試劑盒和總RNA提取試劑盒說明書提取RNA后,使用qRT-PCR的方法測定各組中miR-381-3p的表達(dá)量。使用Nanodrop測定RNA含量,根據(jù)體積與濃度調(diào)至一致后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件:37 ℃ 2 min,42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,4 ℃ 保存。將所得cDNA按照Taqman miRNA kit試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,所用PCR引物序列詳見表2。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)次數(shù)40次。使用2-ΔΔCt計(jì)算公式得出miRNA、mRNA的表達(dá)量。

表2 引物序列

1.7 流式細(xì)胞術(shù)按5×105/ml密度將AML細(xì)胞種植在6孔板中,按照1.5項(xiàng)處理后的AML細(xì)胞使用預(yù)冷的PBS沖洗干凈后,加入胰酶消化后收集細(xì)胞,以800 r/min離心5 min獲得沉淀,使用PBS重懸細(xì)胞后分裝,分別加入PI和Annexin V-FITC抗體后,設(shè)置對(duì)照組,避光情況下上機(jī)檢測。

1.8 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)期生長的AML細(xì)胞按5×105/ml密度種植在24孔板中并設(shè)置空白組,培養(yǎng)12 h后,每組設(shè)置3個(gè)對(duì)照組,按照1.5項(xiàng)處理細(xì)胞,每孔加入25 μl CCK-8試劑,避光,37 ℃條件中孵育1.5 h,測定酶標(biāo)儀在450 nm吸光度時(shí)的吸光度(absorbance, A)值,計(jì)算細(xì)胞的增殖率。計(jì)算方法:增殖率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析正常組與AML組中差異性表達(dá)的microRNAs通過在GEO數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)于AML的microRNA表達(dá)矩陣,確定數(shù)據(jù)庫為GSE142700,在眾多差異性表達(dá)的microRNA中尋找到miR-381-3p,可以觀察到與正常組比較,AML組中miR-381-3p呈現(xiàn)低表達(dá),見圖1A、1B。

圖1 生物信息學(xué)分析正常組與AML組中差異性表達(dá)的microRNAsA:差異性表達(dá)microRNAs的熱圖;B:差異性表達(dá)microRNAs的火山圖

2.2 患者血清及FAB分期中miR-381-3p的表達(dá)與正常組比較,AML組中miR-381表達(dá)較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2A。又通過對(duì)AML組進(jìn)行FAB分期,分為4組,與正常組比較,各分期中miR-381的表達(dá)均較低,其中M2型的AML患者表達(dá)最低,與正常組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2B。

圖2 納入人群血清中在AML患者及FAB分期中miR-381的表達(dá)情況

2.3 miR-381-3p的表達(dá)與AML患者臨床資料之間的關(guān)系為了分析 miR-381表達(dá)與 AML 臨床資料之間的相關(guān)性,將整個(gè)納入患者按照對(duì)照組中定義為“平均值+2×標(biāo)準(zhǔn)差”的區(qū)間值分為兩組。miR-381的表達(dá)在AML患者中與年齡、性別未見明顯差異(P>0.05)。 兩組外周白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、FAB分型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 miR-381的表達(dá)與患者臨床資料之間的關(guān)系

2.4 miR-381表達(dá)與AML臨床結(jié)果的相關(guān)性在90例患者中獲得了OS、DFS的生存數(shù)據(jù)。 在AML患者中,與低表達(dá)miR-381的患者相比,miR-381高表達(dá)的患者具有較長的OS且兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3A。 此外,按照此分類計(jì)算PFS時(shí)間內(nèi)與miR-381的表達(dá)存在的關(guān)系,結(jié)果顯示與低表達(dá)miR-381的患者相比,miR-381高表達(dá)的患者具有較長的DFS且兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3B。

圖3 AML患者長期OS與PFSA:AML患者60個(gè)月的OS;B:AML患者60個(gè)月的PFS

2.5 AML細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后miR-381的表達(dá)與HS5組相比較,AML細(xì)胞系HL-60和KG-1a中miR-381均低表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)。在HL-60細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染48 h后檢測胞內(nèi)miR-381的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)與control組比較,miR-381 mimics組表達(dá)升高,miR-381 inhibitor組表達(dá)下降(P<0.05)(圖4B)。而mimics NC組與inhibitor NC組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在KG-1a細(xì)胞系中檢測miR-381的表達(dá),結(jié)果與上述細(xì)胞系結(jié)果一致,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C)。

圖4 不同細(xì)胞系及不同處理組中miR-381表達(dá)情況

2.6 過表達(dá)miR-381后促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡如圖5所示,AML細(xì)胞系HL-60通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法將miR-381過表達(dá)后,與control組比較,miR-381mimics組凋亡增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),miR-381 inhibitor組的凋亡比例降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在KG-1a細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-381會(huì)促進(jìn)AML細(xì)胞的凋亡,而使miR-381表達(dá)降低,會(huì)抑制AML細(xì)胞的凋亡。

圖5 不同處理組AML細(xì)胞凋亡情況

2.7 過表達(dá)miR-381后抑制K562細(xì)胞增殖圖6顯示,在AML細(xì)胞系HL-60中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h,與miR-381 mimics組比較,miR-381 inhibitor組、mimics NC組、inhibitor NC組、control組均可促進(jìn)HL-60細(xì)胞增殖(P<0.05);而通過過表達(dá)或敲低miR-381后,與control組相比較,miR-381 mimics組增殖減弱,miR-381 inhibitor組細(xì)胞增殖明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 不同處理組K562細(xì)胞增殖情況A:HL-60細(xì)胞系不同處理組增殖情況;B:KG-1a細(xì)胞系不同處理組凋亡情況;與control組比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

在大數(shù)據(jù)的背景下,microRNA的研究作用逐漸被挖掘,microRNA在腫瘤中的研究也逐漸增多[9-10],因此本研究通過生信分析尋找差異性表達(dá)的miRNAs,在此基礎(chǔ)上得到miR-381-3p在AML中低表達(dá),與臨床資料分析相結(jié)合,得出miR-381的表達(dá)影響AML患者的預(yù)后,并通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-381可以抑制AML細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。表明miR-381可以控制AML細(xì)胞的活性和增殖,為治療白血病提供新依據(jù)。

miR-381-3p在許多腫瘤中都呈現(xiàn)出低表達(dá),大量研究顯示miRNA-381在各種類型的癌癥中具有腫瘤抑制作用,包括胰腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、肝細(xì)胞癌[13]、肺癌[14]、前列腺癌[15]和乳腺癌[16]。但在上皮內(nèi)肉瘤中發(fā)現(xiàn)miR-381-3p呈高表達(dá)[17],與本研究在AML中結(jié)論相反,其原因可能是不同類型的腫瘤,組織來源不同,作用機(jī)制各異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-381-3p在AML中的表達(dá),本研究顯示AML患者miR-381-3p的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組人群,且通過對(duì)AML分類也得到了相同的結(jié)果,無論哪一分類的AML患者miR-381-3p的表達(dá)均低于正常對(duì)照組。該結(jié)果符合前期生物信息學(xué)分析的結(jié)果,均證明miR-381-3p在AML患者中低表達(dá),提示miR-381-3p在臨床中具有較高的診斷價(jià)值。為了進(jìn)一步探討miR-381-3p的表達(dá)在AML患者中表達(dá)的意義,本研究發(fā)現(xiàn)miR-381-3p的表達(dá)與患者的年齡、性別以及外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞之間均無關(guān),這與Li et al[18]在胃癌中的研究結(jié)果相一致。與本研究結(jié)果相一致,出現(xiàn)這些陰性結(jié)果的原因可能是以上因素影響效果很低,較小的影響因素結(jié)果并不會(huì)引起miR-381-3p的變化,因此可以更好地消除這些混雜因素來測定miR-381-3p對(duì)AML的影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-381-3p與AML患者預(yù)后的關(guān)系,本研究隨訪患者60個(gè)月發(fā)現(xiàn)miR-381-3p的表達(dá)與患者的OS、PFS呈現(xiàn)正相關(guān),miR-381-3p的高表達(dá)與AML患者OS和DFS延長有關(guān),進(jìn)一步證明miR-381-3p的低表達(dá)與AML的不良預(yù)后具有相關(guān)性。 這與Huang et al[19]發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌中低表達(dá)miR-381患者具有較差的預(yù)后結(jié)果相一致。以上研究結(jié)果表明miR-381-3p的表達(dá)與患者的預(yù)后密切相關(guān),但具體機(jī)制需進(jìn)一步闡明。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-381-3p對(duì)AML的影響,通過體外培養(yǎng)AML細(xì)胞測定過表達(dá)或敲低miR-381-3p對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。發(fā)現(xiàn)與control組比較,敲低miR-381-3p后可抑制AML細(xì)胞凋亡,促進(jìn)增殖,而過表達(dá)miR-381-3p可以促進(jìn)AML細(xì)胞的凋亡,抑制增殖。以上結(jié)果與Qiao et al[11]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-381可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的結(jié)果相一致,前期研究Fang et al[20]也發(fā)現(xiàn)miR-381靶向CUL4B從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲, Kong et al[21]也發(fā)現(xiàn)miR-381靶向LRP6抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,本研究結(jié)果均與之相一致。對(duì)于miR-381在AML過程中的確切作用及機(jī)制需進(jìn)一步闡明。

綜上所述,miR-381-3p在多種腫瘤中發(fā)揮了重要作用,本研究主要觀察其在AML中的表達(dá)、預(yù)后及對(duì)AML細(xì)胞增殖和凋亡的影響,這為后期研究miRNA 在AML的作用機(jī)制提供思路,為靶向治療AML提供新方向。