外泌體轉運miR-223改善創傷性腦損傷的作用和機制

孫衍昶,徐鵬翔,何青龍,歐陽一彬,莫業和

創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是指由鈍性、穿透力、加速力或減速力等外部物理力量引起的顱腦損傷[1]。當發生TBI后,激活的小膠質細胞迅速遷移到損傷部位并釋放大量炎癥因子,破壞血腦屏障并誘導神經元凋亡,進一步加劇腦組織損傷[2-3]。因此,適當抑制小膠質細胞活化能減少TBI后的腦組織病理損害。外泌體(exosome,Exo)是具有脂質雙層膜結構的微小囊泡,由于其體積小,可有效避免單核巨噬細胞的吞噬作用,并自由穿過血管壁和細胞外基質,因此可作為傳遞載體將信號分子運轉至其他細胞,以影響或調控相關功能[4-5]。作為小的非編碼RNA分子,miRNA通過與靶標mRNA 3′UTR區域配對結合進行轉錄后調控。現已知多種miRNA在TBI后異常表達并參與調控病理進程[6-7]。研究[8]表明,miR-223在腦損傷后表達異常,提高其表達可以抑制炎癥反應,減輕腦組織損傷并減少神經元凋亡。基于此,該研究旨在明確Exo轉運miR-223對TBI大鼠腦組織病變與小膠質細胞激活的影響,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 40只Sprague Dawley雄性大鼠,SPF級,體質量200～220 g,購自海南藥物研究所有限責任公司[許可證號:SCXK(瓊)2020-0007],飼養在通風良好、溫度20～25 ℃、相對濕度50%～60%、光照/黑暗12 h循環的標準化動物飼養房內。動物飼養7 d后檢查無異常即可用于實驗,本研究方案經海南醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準(倫理批準號:H20220124-1)。

1.1.2主要試劑 HEK293細胞(美國ATCC細胞庫),DMEM 培養基、胎牛血清及青-鏈霉素雙抗液(美國Gibco公司),Lipofectamine 2000試劑盒(美國Invitrogen公司),TRIzol(日本TaKaRa公司),MicroRNA反轉錄與定量檢測試劑盒(美國Applied Biosystems公司),通用型外泌體提取試劑盒(江蘇凱基生物公司),RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發光液及DAPI染料(上海碧云天生物研究所),HE染色液(北京百奧博萊生物公司),Nissl染色液(北京索萊寶生物公司),血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6) ELISA檢測試劑盒(上海酶研生物科技公司),Triton X-100(北京凱詩源生物科技公司),兔抗CD9多克隆抗體、兔抗CD63多克隆抗體、兔抗CD81多克隆抗體、兔抗Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)多克隆抗體、兔抗凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-asociated speck-like protein containing,ASC)多克隆抗體、兔抗半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)多克隆抗體、小鼠抗離子鈣接頭蛋白(ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba-1)單克隆抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗與異硫氰酸熒光素標記的二抗(英國Abcam公司),miR-NC質粒與miR-223 mimic質粒交由廣州銳博生物技術公司設計構建。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與轉染 將冷凍的HEK293細胞復蘇,添加DMEM 培養基(含10%胎牛血清與1%青-鏈霉素雙抗液)后置于37 ℃、5%CO2環境下傳代培養。將對數生長期的細胞按照1×105個/孔的密度接種至6孔板,過夜培養,分為3組:對照組、miR-NC組、miR-223組。對照組細胞正常培養不處理,miR-NC組與miR-223組按照Lipofectamine 2000試劑盒使用說明書步驟,分別轉染miR-NC質粒、miR-223 mimic質粒至細胞,轉染6 h后更換為完全培養基,繼續培養48 h,收集細胞。

1.2.2實時熒光定量PCR TRIzol法提取總RNA,1%凝膠電泳檢測RNA質量,紫外分光光度計測定RNA濃度并記錄A260/A280值。選擇A260/A280值在1.8～2.1的RNA樣品,按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒說明書步驟進行逆轉錄反應。再以第一條cDNA鏈為模板,通過實時熒光定量PCR反應測定miR-223表達水平,具體根據TaqMan MicroRNA assay試劑盒說明書配制反應體系,在定量系統上設置程序進行擴增,以U6作為內參基因進行標準化,引物序列如下:miR-223上游引物5′-CGCUAUAUCUUUUAUAUAUA-3′,下游引物5′-CGCUAUCUUUCUAUUAUGACUCCAUAA-3′;U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATA-TAC-3′,下游引物5′-AAAAATATGGAACGCTTCAC-GAATTTG-3′。反應結束后,采用比較循環閾值2-ΔΔCt法計算樣本內miR-223相對表達量,實驗重復3次。

1.2.3Exo的提取與鑒定 提取:PBS洗滌轉染后的細胞,將其置于高速低溫離心機中以4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,移至干凈離心管;加入250 μl Exo分離試劑,輕輕混勻,4 ℃下靜置2 h,再以8 500 r/min離心30 min,棄去上清液,留沉淀,加入無菌PBS重懸,獲得Exo懸液,保存于-80 ℃中。鑒定:吸取10 μl Exo懸液滴入載樣銅網上,室溫吸附10 min,吸棄多余液體,滴加2%醋酸雙氧乙鈾溶液染色1 min,吸棄剩余染色液,自然晾干,將載樣銅網置于樣品室內,通過透射電子顯微鏡觀察Exo形態并攝取圖像。采用納米顆粒跟蹤分析對Exo的布朗運動進行追蹤和分析,以計算直徑和濃度。收集提取的Exo,Western blot測定Exo標志蛋白CD9、CD63及CD81表達情況,并通過實時熒光定量PCR測定miR-223的表達水平。

1.2.4Western blot 在Exo或腦組織中添加RIPA裂解液,提取總蛋白,BCA法對樣品進行定量。100 ℃水浴煮沸使蛋白變性,室溫冷卻后,保存于-20 ℃。配置10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠,固定電泳裝置,向電泳槽注入電泳緩沖液,取等量蛋白樣品上樣至凝膠孔內,選擇適當電壓進行電泳分離蛋白。結束后,將分離的蛋白轉印至NC膜上,浸入5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h。Exo鑒定中以兔抗人CD9、CD63、CD81多克隆抗體作為一抗(1 ∶1 000),細胞測定中兔抗人NLRP3、ASC、Caspase-1多克隆抗體作為一抗(1 ∶1 000),將膜與稀釋的一抗液置于4 ℃下共孵育過夜。次日,TBST洗膜,加入對應二抗(1 ∶5 000),室溫孵育1 h,TBST清洗后,ECL超敏發光液發光顯影,觀察蛋白條帶,并通過Image Pro Plus軟件分析細胞內蛋白條帶灰度值,以GAPDH作為標準化內參蛋白,計算目的蛋白的相對表達量。

1.2.5TBI大鼠模型制備與分組處理 將40只大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、NC-Exo組、miR-223-Exo組,每組10只。參考文獻[9],根據改良Feeney自由落體法制備TBI大鼠模型,將除假手術組外的其余3組大鼠通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉,俯臥位固定于手術臺上,全身消毒,頭部備皮,沿大鼠顱骨正中線作一縱切口,完整暴露右側顱骨,于矢狀縫旁開3 mm位置應用顱骨鉆制作直徑約5 mm的骨窗,將40 g砝碼自上方25 cm高度自由落下,撞擊腦組織,制備TBI大鼠模型,隨后止血并縫合。假手術組除不進行撞擊操作外,其余操作相同。造模結束后,NC-Exo組和miR-223-Exo組大鼠分別通過尾靜脈注入轉染miR-NC質粒、miR-223 mimic質粒細胞來源的Exo(3×109個微粒),假手術組和模型組同時尾靜脈注射等量PBS溶液。

1.2.6HE染色 2周后,頸椎脫臼法處死各組大鼠,在冰盤上分離腦組織,清洗干凈后,置于4%多聚甲醛中固定過夜。將固定好的腦組織經二甲苯透明和梯度乙醇溶液水化,OCT包埋,制備成4 μm厚的切片。切片進行脫水與透明,蘇木精染色5 min,流水沖洗,1%鹽酸/乙醇溶液中分化數秒,流水沖洗,氨水返藍,伊紅染色3 min,再用梯度乙醇溶液脫水,二甲苯透明,滴上中性樹膠覆蓋組織,封片,自然晾干,在光學顯微鏡下觀察腦組織病理學變化并拍攝圖像。

1.2.7Nissl染色 取制備的大鼠腦組織病理切片,二甲苯透明,梯度乙醇水化,加入Nissl染色10 min,蒸餾水洗滌,無水乙醇處理,二甲苯透明,滴上中性樹膠覆蓋組織,封片,自然晾干,在光學顯微鏡下觀察腦組織染色情況并拍攝圖像,尼氏體呈淡紫藍色。

1.2.8ELISA法 2周后,各組大鼠經腹主動脈取血,室溫靜置2 h,以4 000 r/min 4 °C離心10 min,獲得上清液。采用ELISA法對血清樣本中TNF-α、IL-1β、IL-6水平進行測定,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.9免疫熒光雙染法 取制備的各組大鼠腦組織切片,使用含有0.3%Triton X-100的PBS溶液浸泡透膜,冷丙酮固定10 min。滴加適量5%牛血清白蛋白溶液,室溫封閉30 min。棄去原液,滴加兔抗NLRP3多克隆抗體(1 ∶100)與小鼠抗Iba-1單克隆抗體(1 ∶100),進行雙熒光標記,置于4 ℃孵育過夜。PBS清洗切片3次,每次5 min。滴加異硫氰酸熒光素標記的二抗(1 ∶500),室溫孵育1 h。PBS再次清洗切片,DAPI避光染核10 min,抗熒光淬滅封片劑封片,激光掃描共焦顯微鏡下觀察腦組織染色情況并拍攝圖像,通過Image Pro Plus軟件分析蛋白染色的熒光強度。

2 結果

2.1 細胞轉染效果細胞轉染結束后,實時熒光定量PCR測定結果顯示,3組細胞中miR-223相對表達量差異有統計學意義(F=49.850,P<0.001)。miR-223組細胞中miR-223相對表達量顯著高于對照組和miR-NC組(P<0.05),見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR測定轉染后細胞中miR-223表達變化

2.2 Exo鑒定結果在透射顯微鏡下觀察到分離的顆粒物為球形囊泡,類似圓形小碟狀,由脂雙層密封,見圖2A,粒徑峰值大約處于120 nm,見圖2B;Western blot檢測結果顯示,Exo標志蛋白CD9、CD63及CD81均明顯高表達,見圖2C,以上結果說明成功分離到Exo。此外,經實時熒光定量PCR測定發現,3組Exo中miR-223相對表達量差異有統計學意義(F=42.205,P<0.001),miR-223組的miR-223相對表達量顯著高于對照組與miR-NC組(P<0.05),見圖2D,說明成功獲得高表達miR-223的Exo。

圖2 Exo鑒定

2.3 Exo轉運miR-223改善TBI大鼠腦組織病理損傷通過HE染色觀察到假手術組大鼠腦組織內細胞形態規則,大小較為一致,胞質染色均勻;模型組大鼠腦組織間質水腫,細胞形態不規則,胞體腫脹或胞核皺縮、碎裂,且胞核呈深染色;與模型組比較,NC-Exo組大鼠腦組織損傷現象未得到明顯改善,而miR-223-Exo組大鼠腦組織間隙變小,細胞碎裂或胞核皺縮數目減少,損傷程度明顯減小。

經Nissl染色后可見假手術組尼氏體染色均勻,細胞結構清晰且分布均勻,數目較多;模型組大鼠尼氏體排列紊亂,出現壞死與胞核固縮、溶解的現象,數目也明顯減少;與模型組比較,NC-Exo組大鼠尼氏體仍表現為損傷,未發生明顯改變,miR-223-Exo組大鼠尼氏體數量明顯增加,細胞形態恢復正常,見圖3。

圖3 HE染色和Nissl染色觀察各組大鼠腦組織病理學變化 ×200

2.4 Exo轉運miR-223抑制TBI大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平ELISA法測定4組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平,結果顯示,各組間TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異有統計學意義(F=426.975、559.172、299.013,P<0.001)。模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于假手術組(P<0.05);與模型組比較,miR-223-Exo組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低(P<0.05),NC-Exo組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠血清內細胞因子水平比較

2.5 Exo轉運miR-223抑制TBI大鼠腦組織NLRP3與Iba-1熒光表達4組大鼠腦組織切片經免疫熒光染色后顯示,NLRP3與Iba-1的熒光染色強度差異有統計學意義(F=56.117、60.346,P<0.001)。與假手術組比較,模型組大鼠腦組織內NLRP3與Iba-1的熒光染色強度顯著增加(P<0.05);與模型組比較,miR-223-Exo組大鼠腦組織內NLRP3與Iba-1的熒光染色強度顯著減少(P<0.05),NC-Exo組內兩者的染色強度差異無統計學意義(P>0.05),見圖4。

圖4 免疫熒光染色觀察各組大鼠腦組織NLRP3與Iba-1表達 ×100

2.6 Exo轉運miR-223抑制TBI大鼠腦組織內NLRP3炎癥小體途徑相關蛋白表達Western blot測定4組大鼠腦組織內NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達水平,結果顯示,各組間NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量差異均有統計學意義(F=28.546、47.051、41.359,P<0.001)。與假手術組比較,模型組大鼠腦組織內NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量均顯著上調(P<0.05);而與模型組比較,miR-223-Exo組大鼠腦組織內NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量均顯著下調(P<0.05),NC-Exo組與模型組大鼠腦組織內NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05),見圖5。

圖5 Western blot測定各組大鼠腦組織內NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達

3 討論

既往研究表明,miRNA表達水平改變與TBI密切相關,例如,已在TBI大鼠腦組織中miRNA-21-5p表達水平增加,上調miRNA-21-5p表達可以通過抑制炎癥反應和減少細胞凋亡來緩解受損腦微血管內皮屏障的泄漏,改善大鼠神經功能障礙[10];在TBI小鼠中上調miRNA-23a-3p表達能夠抑制皮質神經元凋亡并改善神經功能,有效減輕TBI小鼠腦組織病理損傷[11];上調miRNA-9-5p表達通過激活Hedgehog通路和抑制NF-κB/MMP-9通路來緩解血腦屏障損傷和神經炎癥反應,從而促進TBI后神經功能的恢復[12]。目前,關于miR-223在各種腦損傷的研究報道也不斷增多,Sha et al[13]研究表明電針灸治療顯著降低了缺血性腦損傷大鼠的神經功能缺損評分和腦梗死面積,并揭示這一作用是通過提高梗死皮質組織中miR-223表達水平實現的;Huang et al[14]研究發現在出血后丘腦痛小鼠模型中miR-223表達下降,注射miR-223 agomir能夠抑制炎癥因子表達,并改善丘腦出血誘導的中樞性中風疼痛;Zhao et al[15]研究指出miR-223-3p能夠通過抑制小膠質細胞激活后介導的促炎反應,從而減輕大腦中動脈閉塞再灌注大鼠腦組織損傷。以上研究結果均提示,miR-223具有成為TBI診斷及治療靶標的潛力。

Exo具有生物相容性好、免疫原性低、穩定性高和能夠穿越血腦屏障等特點,因而將其作為藥物或分子遞送載體在包括腦疾病在內的靶向治療中獨具優勢[16-17]。以Exo作為載體運轉miRNA可以改變腦組織結構及功能,這為TBI的治療提供新途徑。高迎吉 等[18]研究表明Exo能夠通過遞送miR-124抑制急性創傷性脊髓損傷大鼠脊髓小膠質細胞活化,減輕炎癥反應,從而對大鼠起到保護作用;Long et al[19]研究指出星形膠質細胞來源的Exo能夠通過運轉miR-873a-5p抑制NF-κB信號通路,減弱小膠質細胞介導的神經炎癥并改善了TBI后神經缺陷;Zhang et al[20]研究表明富集miR-17-92的Exo能夠傳遞miR-17-92至TBI受損組織,從而改善運動和認知功能障礙,減少神經炎癥和增強內源性血管生成,并抑制神經元丟失。本研究結果顯示,經Exo轉運miR-223處理的TBI大鼠腦組織損傷明顯減輕,尼氏體數量增加且細胞形態趨于正常,這表明Exo轉運miR-223能夠有效改善TBI大鼠腦部病理損傷。

TBI分為兩個階段,第一階段為原發性損傷,特征是血腦屏障改變和破壞,血流量減少以及對神經元和神經膠質細胞的直接損傷。第二階段為繼發性損傷,發生在損傷后幾分鐘、幾小時、幾個月甚至幾年內,神經炎癥反應在該階段起核心作用,引起細胞變性以及神經/突觸傳遞和可塑性的改變[21]。神經炎癥反應過程較為復雜,包括小膠質細胞和外周中性粒細胞活化、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤、促炎和抗炎細胞因子釋放以及免疫細胞募集,其中,小膠質細胞激活后誘導促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產生,導致神經系統癥狀和神經功能障礙[3,22]。NLRP3是參與TBI中神經炎癥反應的主要成分之一,TBI發生后受傷腦皮層中NLRP3炎癥小體復合物形成增加,其激活被認為是TBI后初始組織損傷擴增的主要原因[23-24]。作為神經炎癥信號通路的重要靶點,靶向抑制NLRP3炎性小體的形成和激活是TBI的前瞻性療法。已有研究表明miR-223能夠調控NLRP3的表達水平及其相關途徑的激活,從而調控炎癥性損傷,例如,miR-223-3p能夠抑制梅毒螺旋體誘導的血管內皮細胞中NLRP3炎性小體活化,這為梅毒提供潛在的治療靶點[25];miR-223-3p可能通過靶向牙周炎中的NLRP3來調節GSDMD介導的神經凋亡,并抑制NLRP3下游炎癥介質IL-1β和IL-6的分泌[26];miR-223通過直接結合到NLRP3的3′-未翻譯區域來抑制其表達,并降低慢性坐骨神經損傷小鼠脊髓中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達水平,增加了M2型巨噬細胞的比例,從而改善慢性坐骨神經損傷小鼠的神經性疼痛[27]。本研究結果顯示,經Exo轉運miR-223處理的TBI大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,腦組織中小膠質細胞標志物Iba-1與NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達均下降,由此說明,Exo轉運miR-223能夠抑制小膠質細胞激活與NLRP3炎性小體活化,從而降低TBI大鼠神經炎癥反應。

綜上所述,Exo轉運miR-223能夠減輕TBI大鼠腦部病理損傷,抑制小膠質細胞激活與炎癥反應,該作用可能與抑制NLRP3炎性小體活化有關,本研究為TBI的治療提供了新思路。但在此過程中miR-223調控的具體靶標或相關信號通路尚不清楚,有待后續進一步探索。