系統性紅斑狼瘡患者外周血CXCR5-CD4+T細胞上PD1表達及意義

羅 清,張 露,黃自坤,符碧琪,李俊明

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種病因不明的、以免疫性炎癥為突出表現的自身免疫性疾病,其特征是出現多種致病性自身抗體,導致多器官、多組織損傷[1]。雖然SLE的發病機制尚不清楚,但大量研究[2]證實濾泡輔助性T細胞與SLE的發生發展密切相關。近年來發現在自身免疫性疾病炎癥組織和外周血中存在一種新型CD4+T細胞亞群,定義為“外周輔助性T細胞”,即程序性死亡因子1(programmed death 1, PD1)陽性的CXCR5-CD4+T細胞(PD1+CXCR5-CD4+T)[3-4]。且研究[5-7]表明PD1+CXCR5-CD4+T細胞的功能與濾泡輔助性T細胞類似,可促進B細胞向漿細胞的轉化和致病性自身抗體的產生從而參與SLE的致病。但目前并未見系統性的探討PD1+CXCR5-CD4+T細胞上PD1表達平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)的臨床意義。

目前用于SLE診斷的臨床表現和實驗室檢查會造成一定程度的SLE漏診和誤診[8-9]。近期,有研究者提出可采用免疫細胞和常規指標的聯合建模來預測疾病以及評估疾病的嚴重程度[10-11]。該研究首次以PD1+CXCR5-CD4+T細胞為研究目標,聯合常規指標建模,探討CXCR5-CD4+T細胞上PD1的表達含量以及預測模式在SLE預測中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料本研究募集了2019年5—9月在南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科就診的SLE患者47例(男3例,女44例),平均年齡(36.9±13.4)歲,采用的SLE診斷標準為1997年美國風濕病學會(ACR)制定的SLE分類(診斷)標準[12],并排除腫瘤、感染、腎功能衰竭、其他自身免疫性疾病等。詳細收集SLE患者相關臨床信息及實驗室檢查數據,并根據評分標準計算其疾病活動性評分(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)[13],平均SLEDAI(10.3±5.9)分,按SLEDAI是否≥10分,將SLE患者分為活動組22例和非活動組25例。SLE患者根據病情嚴重程度采用激素和(或)免疫抑制藥物(SLEDAI<9分病情輕度活動者用潑尼松或糖皮質激素+羥氯喹/甲氨蝶呤/來氟米特,SLEDAI為10～14分的病情中度活動者用糖皮質激素+環磷酰胺/霉酚酸酯,SLEDAI≥15分病情重度活動者先用糖皮質激素沖擊加環磷酰胺,再按病情中度活動治療方案)進行治療。入選的47例SLE患者有6例在治療前后(至少治療1周)均收集了血液樣本。同時期,收集了35例健康志愿者作為健康對照(healthy control, HC)組(男4例,女31例),并排除具有風濕病史和有風濕病家族史,平均年齡(41.7±9.2)歲。兩組在性別、年齡上差異均無統計學意義。本研究獲得了醫院倫理委員會的批準[批準號:(2022)CDYFYYLK(06-005)]。

1.2 試劑和儀器本研究采用的流式細胞抗體:鼠抗人PD1抗體(fluorescein isothiocyanate-PD1,FITC-PD1)、CXCR5抗體(PC7-CXCR5)購于美國eBioscience公司;鼠抗人CD4抗體(phycoerythrin-texas red,ECD-CD4)及相應的同型對照抗體FITC-IgG1購自美國Beckman Coulter公司。抗核抗體(antinuclear antibodies, ANA)、抗雙鏈DNA抗體(anti-double strand DNA antibody, anti-dsDNA)、抗Sm抗體(anti-Smith antibody, anti-Sm)、抗SSA抗體(anti-Sj?gren syndrome A antigen antibody, anti-SSA)、抗SSB抗體(anti-Sj?gren syndrome B antigen antibody, anti-SSB)、anti-Ro52、抗組蛋白抗體(anti-Histone)、抗核小體抗體(anti-nucleosome, anti-AnuA)、抗抗糖體蛋白P抗體(anti-ribosomal P-protein antibody, anti-Rib-P)檢測試劑盒購自歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分離液(Ficoll-Paque)購于美國Sigma公司。流式細胞儀Cytomics FC 500購于美國Beckman Coulter公司,采用的分析軟件為儀器自帶的CXP分析系統,動態血沉儀購自北京普利生公司,IMMAGE800購自美國Beckman Coulter公司,XN-10型儀器購自日本 Sysmex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1標本采集及外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)提取 分別空腹采集每例HC和SLE患者5 ml 乙二胺四乙酸抗凝外周血,采集當天對抗凝全血標本進行實驗檢測。按照PBMC Ficoll-Paque分離液操作規程,將收集的新鮮受試者全血、磷酸鹽緩沖液、Ficoll-Paque分離液按照三者同等比例混合,常溫1 500 r/min離心20 min后緩慢降速至停止,吸出的中間白膜層即為PBMC,采用磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸,用于后續流式檢測。

1.3.2流式細胞術檢測PBMC表面分子 各取受試者100 μl 生理鹽水重懸的PBMC(2×105)加入3個待測試管中,分別加入以下組合流式檢測抗體各10 μl:ECD-CD4、PC7-CXCR5、FITC-IgGl;ECD-CD4、PC7-CXCR5、FITC-PD1;PC5-CD19、PE-CD27、FITC-CD38在4 ℃條件下避光孵育30 min,如有殘留的紅細胞,則需采用紅細胞裂解處理,再生理鹽水洗滌,1 500 r/min離心5 min,棄上清液,重懸后用Cytomics FC 500流式細胞儀檢測分析,使用自帶分析軟件分析PD1在CXCR5-CD4+細胞上的表達情況以及漿母細胞(CD19+CD27+CD38+)的比例。

1.3.3SLE的其他實驗室指標檢測 采用動態血沉儀法檢測紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR);采用速率散色比濁法檢測C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)、補體C3(complement 3, C3)和補體C4(complement 4, C4);采用間接免疫熒光法檢測ANA和anti-dsDNA,采用線性印記法檢測anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Ro52、anti-Histone、 anti-AnuA、anti-Rib-P;采用XN-10型儀器檢測血常規指標,獲取白細胞計數(white blood cell, WBC)、血小板計數(platelet, PLT)、淋巴細胞計數(lymphocyte, L)、淋巴細胞百分比(percentage of lymphocyte, L%)、單核細胞計數(monocyte, M)、單核細胞百分比(percentage of monocyte, M%)、中性粒細胞計數(neutrophil, N)、中性粒細胞百分比(percentage of neutrophil, N%)、血紅蛋白(hemoglobin, HGB)、血細胞比容(hematocrit, HCT),并根據這些指標計算LMR(L/M)、NLR(N/L)、PLR(PLT/L)、SII(PLT×N/L)、dNLR[N/(WBC-N)]、MNR(M/N)、PMR(PLT/M)、PNR(PLT/N)。

2 結果

2.1 PD1在SLE患者和HC外周血CXCR5-CD4+T 細胞的表達水平SLE患者PD1+CXCR5-CD4+T 細胞百分率[(25.27±12.65)%vs(17.75±8.42)%]高于HC,差異有統計學意義(P=0.008 3,U=540.5),見圖1B;SLE 患者CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI[(2.23±0.57)vs(1.61±0.22)]高于HC,差異有統計學意義(P<0.000 1,U=187.0),見圖1C。

2.2 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T 細胞PD1表達水平與疾病活動性指標、漿母細胞比例相關將反映SLE患者疾病活動性指標(SLEDAI、ESR、CRP、WBC、紅細胞(red blood cell,RBC)、HGB、HCT、PLT、L、L%、M、M%、N、N%、NLR、PLR、LMR、dNLR、SII、MNR、PMR、PNR、IgG、C3、C4、ANA、anti-dsDNA、anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Ro52、anti-Histone、anti-AnuA、anti-Rib-P、治療、關節炎、皮疹、脫發、漿膜炎、口腔潰瘍、腎臟損傷等)與CXCR5-CD4+T 細胞PD1表達水平進行相關性分析。結果顯示,PD1+CXCR5-CD4+T 細胞百分率與C3呈負相關,與LMR有負相關的趨勢,但差異無統計學意義,見表1。PD1+CXCR5-CD4+T 細胞百分率在anti-SSA、anti-Histone陽性的SLE患者高于陰性者,治療后PD1+CXCR5-CD4+T 細胞百分率低于治療前,見表2;并未發現PD1+CXCR5-CD4+T 細胞百分率與其他指標相關;CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI與SLEDAI、ESR、CRP、N%、NLR、dNLR呈正相關,與RBC、HGB、HCT、L、L%、LMR呈負相關,見表1。CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI在anti-SSA陽性的SLE患者有高于陰性者的趨勢,但差異無統計學意義,CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI在anti-Ro52陽性的SLE患者高于陰性者,治療后CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI低于治療前,CXCR5-CD4+T 細胞PD1表達的MFI在腎臟損傷SLE患者有高于陰性者的趨勢,但差異無統計學意義,見表3;并未發現CXCR5-CD4+T 細胞PD1表達的MFI與其他指標相關。

表1 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T細胞PD1的表達與疾病活動性指標、漿母細胞比例相關性分析

表2 SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T 細胞百分率與疾病活動性指標的關系

表3 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T 細胞PD1表達的MFI與疾病活動性指標的關系

自身抗體的產生與B細胞轉化為漿母細胞(CD19+CD27+CD38+)的能力有關,進一步分析SLE患者外周血CXCR5-CD4+T細胞PD1表達水平與漿母細胞比例的關系發現,SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T細胞百分率、CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI均與漿母細胞比例呈正相關,見表1。

表4 納入PD1+CXCR5-CD4+T細胞百分率、CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI的方程

2.4 CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和常規實驗室指標對SLE的預測價值采用ROC評估CXCR5-CD4+T細胞PD1表達水平對SLE的預測價值,結果顯示PD1+CXCR5-CD4+T細胞百分率、CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI、聯合PD1+CXCR5-CD4+T細胞百分率和CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI預測SLE的AUC分別為0.671、0.886、0.878,敏感度分別為36.17%、87.23%、65.96%,特異度分別為97.14%、77.14%、97.14%,見圖2、表5。

表5 外周血CXCR5-CD4+T 細胞PD1表達水平對 SLE患者的預測效能

圖2 外周血CXCR5-CD4+T 細胞PD1表達水平對 SLE患者的預測作用

如表6所示,SLE患者與HC的常規實驗室指標中,RBC、HGB、HCT、PLT、L、L%、M%、N%、NLR、PLR、LMR、dNLR、SII、PMR、PNR在兩組之間存在差異(P<0.05)。ROC曲線分析這些差異常規實驗室指標對SLE的預測價值發現,RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR的AUC大于0.800。由于標本量不夠大,本研究選擇SLE的危險因素CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和AUC大于0.800的常規實驗室指標(RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR)進行單因素和多因素分析,篩選出可用于SLE預測建模的指標,如表7所示,CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和HGB用于預測建模。根據邏輯回歸系數,本研究構建的SLE預測模型為:P=8.41×CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI-0.27×HGB+19.80,P值為預測數值。計算各個樣本的預測數值,SLE患者的預測數值[(9.17±9.07)vs(-3.86±2.39)]高于HC(P<0.000 1,U=35.0),見圖3A。采用ROC曲線分析預測模式對SLE的預測價值,發現Cut-off值為-0.204時,其AUC、敏感度、特異度分別為0.979、95.74%、97.14%,見圖3B。且預測模式與SLEDAI呈正相關(rs=0.313 6,P=0.030 3),見圖3C。

表6 SLE患者和HC常規實驗室指標特點和指標預測價值

表7 單因素和多因素分析與SLE相關的危險因素

圖3 基于CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和HGB預測模式的預測價值

3 討論

外周輔助性T細胞(PD1+CXCR5-CD4+T)是近年來新發現的一群CD4+T細胞亞群,其可促進B細胞向漿細胞轉化和致病性自身抗體的產生[3-4]。國外學者Bocharnikov et al[6]和國內學者[5, 7]的報道均表明PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例在SLE的發生發展中發揮著至關重要的作用。但關于PD1+CXCR5-CD4+T細胞上PD1表達MFI與SLE的關系卻鮮為報道。本研究對SLE患者和HC外周血PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI進行檢測,結果顯示兩組外周血PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI均不相同,SLE患者PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI顯著高于HC,且隨著疾病活動度的增加而升高;在抗體陽性患者組,PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI均高于對應陰性組,提示PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例越高、PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI越高,患者體內的自身抗體越多,SLE病情越活躍。進一步研究分析發現,PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI均與促進抗體產生的漿母細胞比例呈正相關。此外,SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI均與SLE治療相關,治療緩解后PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI均下降。這些關于SLE患者中PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例的研究結果與相關研究[5-7]是一致的。此外,本研究結果還表明PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI越強,產生的自身抗體越多、SLE患者活動性和疾病嚴重程度越高。這與張力 等[14]關于濾泡輔助性T細胞上PD1表達可以作為評估自身免疫病疾病嚴重程度和活動性指標相一致。

雖然PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI均與SLE患者活動性和疾病嚴重程度相關,但PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI與更多的SLE患者活動性和疾病嚴重程度指標(SLEDAI、ESR、CRP、RBC、HGB、HCT、L、L%、N%、NLR、LMR、dNLR)相關,表明PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI可能在SLE致病中所起的作用更強。且進一步邏輯回歸分析上調的PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例、CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI是否為SLE的發病危險因素,結果表明上調的CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI是SLE發病的危險因素,而PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例并不是。這些研究結果表明PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達強弱在SLE致病中起主導作用。

近年來,有學者致力于探討免疫細胞以及免疫細胞結合常規指標對免疫相關性疾病的預測價值[10, 15-16]。本研究采用ROC曲線分析PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例、CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI、聯合兩者對SLE的預測價值發現,CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI的AUC最高(0.886),敏感度和特異度分別為87.23%、77.14%。 此外有研究[11]表明血常規以及相關比值等指標可用于疾病以及疾病嚴重程度的預測,考慮到SLE患者血常規指標存在異常,并且血常規指標是簡便、低廉、易獲取的指標,本研究分析這些指標對SLE的預測價值發現,RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR的AUC大于0.800。進一步采用單因素和多因素分析篩選CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI、RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR是否為SLE相關危險因素時,發現CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和HGB是其危險因素。本研究將CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和HGB納入SLE預測模型,升高的預測數值對SLE具有明顯的預測作用,其AUC、敏感度、特異度分別為0.979、95.74%、97.14%,并且與SLE疾病活動性明顯相關。這些結果表明包含CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和HGB的預測模型不僅可以用于SLE的預測,還可以用于疾病活動性的評估。

此外,本文還存在一些不足之處:一是標本量太少;二是未探討SLE預測模型在疾病對照組中的數值以及區分SLE與其他疾病的能力。

綜上所述,SLE患者升高的外周血PD1+CXCR5-CD4+T細胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI與疾病嚴重程度及活動性相關,升高的PD1+CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI是SLE的危險因素,基于CXCR5-CD4+T細胞PD1表達MFI和HGB的SLE預測模型既可以用于SLE的預測,也可以用于疾病活動性的評估。但仍需進一步探討SLE預測模型在SLE預測及疾病活動性評估中的作用。