小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體的構建

許 媛,魏 偉,常 艷

色氨酸 2,3-雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2)是犬尿氨酸代謝通路的限速酶之一,是調節系統色氨酸(tryptophan, Trp)水平的關鍵酶[1]。與對照組小鼠相比,TDO2基因敲除(TDO2 knockout, TDO2-KO)小鼠生長發育正常,血漿Trp濃度高于對照組小鼠8～9倍[2]。TDO2介導的犬尿氨酸代謝通路異常在癌癥、中樞神經系統疾病和自身免疫病中發揮重要作用。研究[3]顯示,TDO2代謝產物激活芳香烴受體,從而參與腫瘤免疫逃逸。TDO2-KO小鼠的海馬體神經活動增強,表現出神經保護現象[4]。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型研究中發現TDO2缺失緩解了神經炎癥[5]。研究[6-7]表明TDO2在佐劑誘導關節炎大鼠體內表達升高可能介導了滑膜炎癥和關節破壞。為了進一步研究TDO2在特定組織和細胞類型上的生物學功能以及在疾病狀態下所參與的分子機制,利用CRISPR/Cas9 技術構建敲除TDO2-201轉錄本外顯子3的打靶載體,為進一步構建TDO2基因條件性敲除小鼠奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇C57BL/6小鼠,與南京集萃藥康生物科技公司實驗室合作,采用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術構建TDO2基因條件性敲除打靶載體。實驗動物飼養和繁育均符合安徽醫科大學實驗動物管理與倫理委員會相關規定,倫理批準號:PZ-2022-007。

1.2 主要試劑蛋白酶 K(批號: WXBD6886V)(美國 Sigma 公司);Marker I DNA標準分子量Ladder(批號:20220311)(北京索萊寶科技有限公司),50×TAE(批號:765782AA)(博邁德生物);Agarose(批號:EZ6789D112)(賽國生物科技);1× TE pH 8.0(批號:70105832)、核酸染料(批號:22116561)(biosharp生物科技公司);2×Rapid Taq Master Mix(批號:7E572H1)(諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.3 主要儀器臺式梯度PCR儀Thermal Cycler(型號:T100TM)(美國 Bio-Rad公司);HH數顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司);天能Tanon瓊脂糖凝膠電泳儀(型號:EPS-300)、全自動數碼凝膠圖像分析系統(型號:Tanon-1600)(上海天能公司)。

1.4 CRISPR-Cas9 靶向位點和Donor載體的設計以及sgRNA的合成根據TDO2 Gene ID(56720)小鼠基因組序列信息,發現TDO2 基因有4個轉錄本,根據TDO2基因的結構,推薦選擇敲除區為TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)轉錄本的第3號外顯子。該區域包含91 bp的編碼序列,敲除后將破壞TDO2蛋白質功能。利用CRISPR/Cas9 技術對TDO2基因進行改造,在TDO2基因的打靶區域兩側各放置同向Loxp元件。設計針對TDO2基因的第3號外顯子的寡聚核苷酸鏈序列sgRNA,sgRNA序列信息見表1。根據sgRNA序列設計并合成Donor載體。

表1 sgRNA 序列信息

1.5 Cas9 mRNA、sgRNA和donor片段混合體的受精卵顯微注射和移植將Cas9 mRNA、sgRNA和純化后的donor片段混合體顯微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6母鼠的子宮中,獲得陽性F0小鼠,經PCR證實Loxp突變基因已經整合到小鼠染色體上。小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體構建策略見圖1。Cas9蛋白被sgRNA誘導與靶位點結合,從而導致外顯子3堿基序列缺失,并在斷裂處插入Loxp位點修飾的靶基因序列。最后獲得小鼠TDO2基因條件敲除打靶載體。

圖1 小鼠TDO2基因條件敲除打靶載體的構建策略

1.6 TDO2基因條件性敲除打靶載體的PCR鑒定

1.6.1小鼠尾組織基因組DNA的提取 取鼠尾組織50～100 mg(1周齡鼠尾2～5 mm),加入鼠尾裂解液0.5 ml,在55 ℃下,輕微震蕩混勻消化8～12 h至無肉眼可見塊狀或絮狀物,采用乙醇沉淀提取法進一步提取基因組DNA。12 000 r/min離心1 min,將上清液0.450 ml移入新EP管中,留少許以免槍頭接觸殘留組織或毛發。再加入0.9 ml無水乙醇,上下緩慢顛倒混勻5～10次,12 000 r/min 離心 15 min。棄上清液,加入1 ml 75%乙醇溶液,上下緩慢顛倒洗滌5～10次,12 000 r/min 離心5 min。棄上清液,保持離心管開蓋狀態,室溫晾置5～10 min。加入0.3 ml DEPC水置于37 ℃下溶解 DNA,30 min后用無酶槍頭吹打混勻。4 ℃冰箱保存備用。

1.6.2PCR鑒定

1.6.2.1 PCR體系 反應總體系25 μl,分別加入Taq Master Mix,Dye Plus 12.5 μl, ddH2O 9.5 μl,引物1 μl,模板基因組DNA 1 μl。PCR儀擴增,95 ℃預變性 5 min,95 ℃變性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環,72 ℃ 5 min 終止反應。基因鑒定策略見圖2,引物信息見表2。圖2顯示,基于sgRNA序列,設計攜帶靶位點同源區和Loxp位點的重組質粒,并在該靶區設計引物,用于小鼠后續基因鑒定。

圖2 小鼠TDO2基因條件敲除打靶載體基因型鑒定策略

表2 TDO2flox/flox小鼠引物信息

1.6.2.2 凝膠電泳 配置2%的瓊脂糖凝膠,每孔點樣10 μl,marker 5 μl,以140 V、400 mA的條件電泳30 min。電泳結束后,拍照觀察。根據DNA marker,對比 PCR條帶位置,判斷是純合子還是雜合子。

1.7 純合突變小鼠(TDO2flox/flox)的生長和繁育

將PCR和測序鑒定的陽性F0代小鼠與C57BL/6小鼠交配獲得F1代小鼠。利用PCR鑒定篩選出F1代雜合子,將其作為親本。交配繁育后得到F2代,PCR鑒定后,選擇最佳繁育路線,最終得到兩條染色體均帶有Loxp點的純合突變小鼠(以下簡稱TDO2flox/flox)。

TDO2flox/flox小鼠飼養于 SPF 級環境中,飼養室內的溫度保持在 22～28 ℃,相對濕度維持在 40%～60%。飼料為無菌全價營養顆粒料,飲用水為高壓滅菌后的純凈水。定期觀察登記小鼠體質量變化、精神狀態等情況。孕鼠的妊娠期一般20 d左右;小鼠出生后5～7 d可進行剪尾操作;3周左右可將雌雄小鼠分開飼養。一般雄鼠性成熟為8周齡,雌鼠6周齡左右。同時觀察TDO2flox/flox小鼠的飲食、活動、體質量變化等情況。

1.8 統計學處理數據均用Mean±SEM表示,采用SPSS 25.0 軟件分析數據,采用單因素方差(One-way ANVOA)分析進行比較,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TDO2flox/flox小鼠的鑒定結果以JS04371-Tdo2-5wt-tF1和JS04371-Tdo2-5wt-tR1為引物的情況下,PCR反應獲得305 bp和407 bp雙條帶的為TDO2-flox雜合子小鼠;獲得305 bp條帶的為同窩WT小鼠;獲得407 bp條帶的為TDO2flox/flox小鼠,見圖3A。以JS04371-Tdo2-3wt-tF1和JS04371-Tdo2-3wt-tR1為引物,PCR反應獲得305 bp和408 bp雙條帶的為TDO2-flox雜合子小鼠;獲得305 bp條帶的為WT小鼠;獲得408 bp條帶的為TDO2flox/flox小鼠,見圖3B。TDO2flox/flox小鼠之間進行雜交,最終得到大量TDO2flox/flox小鼠,為后續構建TDO2基因條件敲除小鼠模型奠定了基礎。圖3A采用JS04371-Tdo2-5wt-tF1PCR和JS04371-Tdo2-5wt-tR1為引物, Line1為陰性對照,Line2、3、4為陽性對照,分別為TDO2-flox雜合子小鼠、同窩WT小鼠、TDO2flox/flox小鼠。80、82號鼠為TDO2-flox雜合子小鼠,81、83、84、85、86、87均為TDO2flox/flox小鼠。圖3B采用JS04371-Tdo2-3wt-tF1和JS04371-Tdo2-3wt-tR1為引物,結果同圖3A。同時對基因鑒定結果陽性的引物擴增產物進行測序,檢測Loxp位點信息(ATAACT TCGTAT AGCATA CATTAT ACGAAG TTAT),根據測序結果進一步證實小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體構建成功,測序結果見圖4。

圖4 TDO2flox/flox小鼠基因測序結果

2.2 TDO2flox/flox小鼠的生長和繁育情況與同窩WT小鼠相比,TDO2flox/flox小鼠的飲食、活動、體質量變化正常。對不同性別和基因型的 8～14周齡小鼠進行體質量分析(n=10)。結果顯示,同一基因型小鼠,雌性小鼠的體質量低于雄性小鼠,差異有統計學意義(F=16.33,P<0.01);同一性別中,TDO2flox/flox小鼠與同窩WT小鼠相比,體質量無明顯差異,雄性WT:(22.53±0.313 1) mg;雄性TDO2flox/flox:(22.28±0.423 7) mg;雌性WT:(19.88±0.258 1) mg;雌性TDO2flox/flox:(20.58±0.254 2) mg。TDO2flox/flox小鼠性成熟時間表現為:雄鼠 8 周,雌鼠6周左右;母鼠妊娠期為 19～21 d,每胎產5～6只幼鼠,成活率>95%,與同窩WT 小鼠繁殖情況無差異。

3 討論

TDO2表達異常導致犬尿氨酸代謝通路紊亂,在中樞神經系統疾病、腫瘤和自身免疫病等多種疾病中發揮重要作用。研究[3,8]表明,在疾病狀態下,TDO2介導免疫細胞功能異常,參與腫瘤細胞和各組織細胞的病理機制。課題組首次發現TDO2在免疫細胞中均有表達,如巨噬細胞、B細胞和T細胞等,提示TDO2在免疫調節和維持局部免疫穩態中具有潛在作用[9]。課題組為了進一步研究TDO2在靶細胞和靶組織中的病理機制,采用CRISPR/Cas9 技術構建了小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體。

本實驗首先利用CRISPR Design工具(http://crispr.mit.edu/)[10],結合TDO2 Gene ID(56720)小鼠基因組序列信息,設計針對TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)轉錄本的第3號外顯子打靶位點的sgRNA,再根據sgRNA序列設計Donor載體。其次,制備Cas9 mRNA、sgRNA和Donor片段產物。將合成后的2條單鏈寡聚核苷酸sgRNA序列退火(95 ℃ 5 min后自然降至室溫)形成雙鏈DNA,經T7 RNA聚合酶合成sgRNA。Cas9表達質粒,經AgeⅠ酶切線性化,體外利用T7 RNA聚合酶合成Cas9 mRNA。然后將轉錄好的sgRNA和Cas9 mRNA以及純化后的Donor載體片段顯微注射到受精卵中,sgRNA的堿基與靶基因的序列特異性結合,進而誘導Cas9酶對第3號外顯子進行切割,導致DNA雙鏈斷裂,在斷裂處插入經Loxp位點修飾的第3號外顯子基因序列,隨后將胚胎轉移到假孕動物中以產生F0代[11]。最后將陽性F0代小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配獲得穩定的F1代小鼠,通過F1代小鼠之間的雜交得到TDO2flox/flox小鼠。

通過PCR鑒定發現,小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體遺傳穩定。與同窩WT小鼠相比,TDO2flox/flox小鼠在繁育過程中,生長發育正常。對不同性別和基因型的 8～14周齡小鼠進行體質量情況分析,結果表明,與同窩WT小鼠相比,TDO2flox/flox小鼠體質量無差異。利用CRISPR/Cas9技術成功構建小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體,不僅為構建TDO2基因條件性敲除小鼠模型奠定基礎,也為進一步研究TDO2基因在靶組織和細胞上的功能和在疾病狀態下的病理機制奠定了基礎。