紫草酸甲酯抑制海馬Nox4介導的鐵死亡改善小鼠術后學習記憶障礙

劉鐵龍,亓文強,江洪洋,王瑞雪,代志剛,殷姜文

學習記憶障礙是麻醉和手術后常發生的并發癥,嚴重影響患者生活質量并增加醫療費用及社會負擔[1-3]。研究[4-5]表明,學習記憶障礙潛在的發生機制是麻醉和手術引起的神經炎癥和氧化應激。紫草酸甲酯(paederosidic acid methyl ester,PAME)是從雞矢藤中提取的環烯醚萜類單體,具有抗炎、抗氧化應激和鎮痛等作用[6-7]。因此,PAME可能具有改善學習記憶障礙的潛在藥理作用。研究表明,NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)介導的氧化應激水平增加引起鐵死亡[8],且海馬區鐵死亡會導致患有膿毒癥相關性腦病的大鼠發生學習記憶障礙[9]。PAME具有抗氧化應激作用,其對Nox4介導的氧化應激水平增加引起的鐵死亡及其導致的學習記憶障礙是否產生抑制作用尚無報道。因此,該研究建立剖腹探查術小鼠動物模型,使用PAME進行干預治療,觀察其對術后小鼠學習記憶的作用及其與Nox4介導的鐵死亡途徑的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器PAME(貨號:HY-N2433,美國Merck公司);異氟烷(貨號:R510-22,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);Nox4過表達AAV病毒(上海漢恒生物科技有限公司);Nox4抗體(貨號:ab133303)、山羊抗兔TRITC熒光二抗(貨號:ab8135)(英國Abcam公司);長鏈脂酰輔酶A合成酶4(long chain acyl CoA synthetase 4,ACSL4)抗體(貨號:A04372-2)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抗體(貨號:BM5231)(武漢博士德生物工程有限公司);GAPDH(貨號:TA-08)、山羊抗兔IgG二抗(貨號:ZB-2301)、山羊抗小鼠 IgG二抗(貨號:ZB-2305)(北京中杉金橋生物技術有限公司);組織鐵檢測試劑盒(貨號:A039-2-1)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(貨號:E004-1-1)(南京建成生物工程研究所)。

小動物麻醉機(型號:R500,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);低溫高速離心機(型號:1-14k,德國Sigma公司);激光共聚焦掃描顯微鏡(型號:LSM710,德國Carl Zeiss公司);Labmaze動物行為學分析系統(型號:V3.0)、小鼠腦立體定位儀(型號:ZS-FD,北京眾實迪創科技發展有限責任公司);電泳槽(型號:DYCZ-21,北京六一生物科技有限公司);精密微量注射泵(型號:QSI,美國Stoelting公司);化學發光成像儀(型號:Tanon-2500,上海天能生命科學有限公司)。

1.2 實驗動物選擇12～14月齡C57BL/6J雄性小鼠108只,體質量30 ～35 g,購于濟南朋悅實驗動物有限公司。實驗小鼠飼養在恒溫動物房,溫度(25±2)℃,濕度(55±10)%,12 h光照/黑暗周期,小鼠自由進食和飲水。本研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理審查委員會批準(批準號:A2021-074-01)。

1.3 實驗分組采用隨機數字法將C57BL/6J雄性小鼠隨機分為6組(n=18):① Sham組:小鼠麻醉后自然蘇醒,未做特殊處理。② 手術組:將小鼠用2%異氟烷吸入麻醉,常規消毒后在腹中線上剪開約1 cm的垂直切口,然后依次探查腸、肝、脾、腎等器官,探查完畢并確認腹腔無出血,用4-0無菌縫線逐層縫合傷口,術畢置于保溫箱中蘇醒。③ 手術+PAME組(PAME組):在術后第1天開始行20 mg/kg PAME灌胃,連續7 d。④ 手術+Nox4腺相關病毒過表達組(Nox4過表達組):Nox4過表達腺相關病毒于術前28 d通過腦立體定位儀注射到小鼠海馬腦區,28 d后常規進行手術。⑤ 手術+Nox4腺相關病毒空載組(AAV空載組):術前28 d通過腦立體定位儀將AAV空載病毒注射到小鼠海馬腦區,28 d后常規進行手術。⑥ 手術+PAME+Nox4過表達組(PN組):手術前28 d將Nox4過表達腺相關病毒通過腦立體定位儀注射到小鼠海馬腦區,手術后給予20 mg/kg PAME灌胃處理,連續7 d。PAME劑量及灌胃時間根據本課題組預實驗和Chen et al[10]研究方案確定。

1.4 小鼠海馬AAVs立體定位注射小鼠面罩吸入異氟烷麻醉,通過耳桿和齒栓將小鼠頭部固定于腦立體定位儀上,用顱骨鉆在小鼠顱骨表面鉆孔,穿破顱骨后,按小鼠海馬坐標(前囟向后2.5 mm,向左/右旁開2.0 mm,深度1.8 mm),將尖端帶有玻璃微電極的微量注射針以0.02 μl/min的速度注入AAVs病毒,注射時間25 min,總體積0.5 μl,注射完畢針尖停留10 min,緩慢移除針尖,縫合頭皮,麻醉蘇醒后放入籠中單獨飼養。

1.5 Morris水迷宮實驗調節動物行為學分析系統將圓形水池分為4個象限。池內加入適量的水并保持水溫在23～25 ℃,將一個圓柱狀平臺放置于第二象限正中。實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗:從術前第6天起至術前第2天,共測量5次,每天在固定時間按順時針方向從4個不同象限作為入水點,記錄小鼠尋找平臺的時間即逃逸潛伏期,如果在90 s內未找到平臺,則將小鼠引上平臺并保持15 s,此時逃逸潛伏期記錄為90 s;空間探索實驗:術前1 d撤除平臺,將小鼠在第四象限面向池壁放入水中,行為學軌跡分析儀記錄小鼠在90 s內穿越平臺位置的次數以及在第二象限探索的時間。用同樣的方法在術后第1、3、7天內重復空間探索實驗[11]。

1.6 條件性恐懼實驗按照已報道的實驗流程[12],在術前第2天,將各組小鼠放入條件性恐懼刺激箱內,適應2 min,同時給予聲音刺激(70 dB)及足底電刺激(0.7 A),間隔1 min后重復以上刺激,連續20次。結束后小鼠在刺激箱內停留2 min后再放回鼠籠。在術前1 d、術后第1、3、7天將各組小鼠再次放入條件性恐懼刺激箱內,適應2 min,僅給予10 s聲音刺激(70 dB),觀察并記錄小鼠僵直時間百分比,重復上述步驟5次,評價小鼠認知功能。

1.7 ROS、海馬組織鐵含量檢測在術后第7天,每組取6只小鼠海馬組織勻漿,按照相應試劑盒說明書采用分光光度法檢測海馬組織ROS水平和鐵含量。

1.8 免疫熒光染色術后第7天,每組各6只小鼠經心臟灌注后取腦,脫水后制備冰凍腦切片,經5% BSA 封閉1 h后滴加Nox4一抗(1 ∶200),4 ℃孵育過夜,PBS洗滌后滴加TRITC標記的熒光二抗(1 ∶500),室溫避光孵育2 h,DAPI液染細胞核 3 min,封片后激光共聚焦顯微鏡觀察,每張切片在200倍鏡下隨機選3個不同視野進行采圖。用Image J軟件進行熒光強度測定。

1.9 Western blot術后第7天,每組取6只小鼠快速斷頭取腦,剝離海馬組織,組織勻漿、RIPA裂解提取蛋白,并用BCA法測定蛋白濃度。經上樣、電泳、轉膜、封閉后,選擇GAPDH(1 ∶1 000)、目標蛋白Nox4(1 ∶1 500)以及鐵死亡標志性蛋白ACSL4(1 ∶1 000)和 GPX4(1 ∶1 000)一抗 4 ℃孵育過夜,二抗山羊抗兔(1 ∶2 000)和山羊抗小鼠(1 ∶2 000)室溫孵育 2 h后滴加化學發光試劑曝光,Image J軟件測定條帶灰度值,并以 GAPDH為參照,統計Nox4、ACSL4和 GPX4相對表達量。

2 結果

2.1 PAME對小鼠術后學習記憶的影響

2.1.1各組術前行為學差異無統計學意義 各組術前定位航行實驗結果差異無統計學意義(F=0.348,P>0.05),但隨著訓練天數的增加,各組找到平臺所需平均時間縮短;術前空間探索實驗各組小鼠在90 s內穿越平臺位置的次數以及在第二象限探索的時間差異均無統計學意義(F=0.228,P>0.05;F=0.397,P>0.05)。術前條件性恐懼實驗各組小鼠僵直時間百分比差異也無統計學意義(F=0.365,P>0.05)。見圖 1。

2.1.2PAME增加小鼠術后穿越平臺次數、延長空間探索時間 空間探索實驗中記錄的各組小鼠的游泳軌跡如圖 2所示。與Sham組相比,手術組小鼠在術后第1、3、7天穿越平臺次數減少(P<0.001),在第二象限探索時間更短(P<0.001)。但在給予PAME治療(即PAME組)的小鼠穿越平臺次數和第二象限探索時間比手術組增加(P<0.001,P<0.05)。與手術組相比,Nox4過表達組的小鼠穿越平臺次數更少、第二象限探索時間更短(P<0.05),但在給予PAME治療后可被逆轉(P<0.001)。AAV空載組與手術組相比差異無統計學意義(P>0.05),見表1、2。

表1 PAME對小鼠術后穿越平臺次數的影響(次,

圖1 術前各組行為學比較

圖2 水迷宮實驗小鼠活動軌跡A:Sham組;B:手術組;C:PAME組;D:Nox4過表達組;E:AAV空載組;F:PN組

表2 PAME對小鼠術后目標象限停留時間的影響

2.1.3PAME增加小鼠術后條件性恐懼實驗僵直時間百分比 與Sham組相比,手術組在術后第1、3、7天小鼠僵直時間百分比減少(P<0.001),在給予PAME治療后,PAME組的小鼠僵直時間百分比增加(P<0.05)。與手術組相比,Nox4過表達組的小鼠僵直時間百分比減少(P<0.05),但在給予PAME治療后小鼠僵直時間百分比增加(P<0.001)。AAV空載組與手術組相比差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 PAME對小鼠術后僵直時間百分比的影響

2.2 PAME抑制小鼠術后海馬組織Nox4介導的鐵死亡

2.2.1PAME降低小鼠術后海馬組織ROS、鐵的含量 小鼠海馬組織ROS和鐵含量檢測結果顯示,手術組小鼠海馬組織ROS和鐵含量高于Sham組(F=40.94,P<0.001;F=36.15,P<0.001),PAME灌胃治療后小鼠海馬組織ROS和鐵含量出現降低(P<0.001)。給予Nox4過表達病毒注射的小鼠海馬組織ROS和鐵含量比單純手術組高(P<0.05),在給予PAME治療后,Nox4過表達組的ROS和鐵含量下降(P<0.001)。AAV空載組與手術組相比,小鼠海馬區ROS和鐵含量差異無統計學意義(P>0.05),見圖3。

圖3 各組ROS和鐵含量變化

2.2.2PAME降低小鼠術后海馬CA1區Nox4的表達 免疫熒光實驗結果顯示,Nox4在小鼠海馬CA1區錐體神經元胞質表達,與Sham組相比,手術組小鼠海馬CA1區Nox4的熒光強度增強(F=175.3,P<0.001),在給予PAME治療后熒光強度降低(P<0.001)。Nox4過表達組比手術組Nox4的熒光強度增加(P<0.01),在給予PAME后出現逆轉(P<0.001)。AAV空載組與手術組相比小鼠海馬CA1區Nox4的熒光強度差異無統計學意義(P>0.05),見圖4。

圖4 免疫熒光實驗檢測各組Nox4的表達變化

2.2.3PAME對小鼠術后海馬組織Nox4及鐵死亡標志性蛋白(ACSL4和GPX4)表達的影響 Western blot實驗結果顯示,與Sham組相比,手術組小鼠海馬組織Nox4表達增加(F=103,P<0.001),鐵死亡標志性蛋白ACSL4的表達增加(F=94.44,P<0.001),GPX4表達水平降低(F=73.9,P<0.001)。在給予PAME治療后,手術組小鼠海馬Nox4蛋白、ACSL4的表達均降低(P<0.001),GPX4表達水平增加(P<0.001)。同時,與手術組相比,Nox4過表達組小鼠海馬Nox4、ACSL4的表達均顯著增加(P<0.001),GPX4表達降低(P<0.001),給予PAME治療后結果出現逆轉(P<0.001)。AAV空載組與手術組相比,小鼠海馬組織Nox4、ACSL4和GPX4的表達差異無統計學意義(P>0.05),見圖5。

圖5 Western blot實驗檢測Nox4、ACSL4、GPX4的表達變化

3 討論

學習記憶障礙作為圍術期常見的并發癥,常導致術后恢復延遲,在“加速康復外科(enhanced recovery after surgery,ERAS)”理念指導下,探討學習記憶功能障礙的產生機制和改善圍術期學習記憶功能受損值得關注并研究。研究[4-7]證實學習記憶能力障礙與神經炎癥和氧化應激有關,而我國傳統中藥雞矢藤具有抗炎和抗氧化應激作用,因此其可能具有改善學習記憶障礙的作用。本研究選用雞矢藤的主要活性物質PAME治療術后學習記憶能力降低的小鼠,發現術后小鼠的認知行為學(Morris水迷宮實驗和條件性恐懼實驗)得到了明顯改善,這一現象證實了PAME能夠改善小鼠術后學習記憶功能。

本研究繼續探討PAME改善術后小鼠學習記憶功能的機制。研究[8-9]表明,鐵死亡可引起學習記憶功能障礙,Nox4介導的氧化應激是導致鐵死亡的主要原因。PAME具有抗氧化應激作用,其可能會通過抑制Nox4介導的氧化應激減輕鐵死亡,改善小鼠術后學習記憶功能障礙。本研究結果顯示,手術組小鼠術后海馬組織ROS、鐵含量明顯增加,Nox4表達上調,鐵死亡標志性蛋白ACSL4表達上調,GPX4表達下調[13]。這些結果與相關研究[14]中鐵死亡的結果一致,表明術后小鼠學習記憶能力降低的發生與海馬組織Nox4介導的氧化應激和鐵死亡相關。給予PAME治療后,發現術后小鼠海馬組織ROS和鐵含量減少,且海馬Nox4表達明顯受到抑制,同時ACSL4生成減少而GPX4表達增多。這一現象初步證實了PAME可能通過Nox4抑制了鐵死亡途徑,改善了小鼠術后學習記憶功能。

為了進一步證實PAME的作用靶點是Nox4,本研究選用了Nox4過表達腺相關病毒這一工具,實現了小鼠海馬區Nox4的過表達。而Nox4過表達會加重氧化應激和鐵死亡,與鐵死亡相關的ROS、鐵含量及ACSL4會明顯增加,GPX4明顯降低[15]。實驗結果表明海馬Nox4過表達后小鼠術后學習記憶損害加重,ROS、鐵含量、ACSL4進一步增加,GPX4顯著降低,提示海馬Nox4介導的鐵死亡可能是小鼠術后發生學習記憶障礙的重要機制。此外,海馬Nox4過表達后的小鼠給予PAME治療,學習記憶功能改善作用、ROS及鐵含量的抑制作用均受到限制,且Nox4、ACSL4表達再次出現增加,GPX4下調,這一現象證明PAME是通過抑制海馬Nox4從而改變下游鐵死亡相關蛋白,抑制了海馬氧化應激和鐵死亡,進而改善了術后學習記憶功能。