基于細菌體系生產雙鏈RNA的條件優化

計慧君,林羿光,付彤煜,鄭思春

(華南師范大學生命科學學院,昆蟲科學與技術研究所,廣州 510631;梅州市華師昆蟲發育生物學與應用技術重點實驗室廣梅園研發中心,梅州 514779)

化學農藥是當前防治害蟲最主要的手段,但化學農藥的長期施用導致環境污染、害蟲抗藥性及食品安全問題日益突出。因此迫切需要探究環保的新型害蟲防治方式(Sharmaetal., 2019; Sparksetal., 2019; Swale, 2019)。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是真核生物中基因表達和抗病毒防御的一種調控方式(Ding and Lu, 2011),自發現以來推動了昆蟲基因功能的研究和害蟲防治手段的發展(Zhu and Palli, 2020)。目前,已知三類小RNA(sRNA)可以在生物體中觸發RNAi,這三類小RNA分別是siRNA、miRNA和piRNA(Zhu and Palli, 2020)。其中,在小/短的RNA(siRNA)介導的途徑中,雙鏈RNA(dsRNA)可以被Dcr2和外源siRNA途徑的R2D2或內源siRNA的LOQ結合,并切割成短的siRNA(Marquesetal., 2010),在siRNA組裝進Argonaute 2(Ago 2)蛋白后,由Ago2和其他RISC相關蛋白(RP)組裝RNA誘導沉默復合物(RISC),最后通過堿基互補配對與靶mRNA結合,并切割靶mRNA(Matrangaetal., 2005)。Gong等人將化學合成的siRNA喂食給小菜蛾Plutellaxylostella,小菜蛾死亡率顯著增加(Gongetal., 2013)。Wang等人在褐飛虱中用dsRNA對NompC基因進行RNA干擾,發現當NompC基因被抑制后,褐飛虱的存活率顯著下調(Wangetal., 2019)。這些研究結果表明dsRNA和siRNA皆可用于害蟲防治。

基于RNAi技術的RNA農藥因其專一、高效和對環境友好等特點,已經成為一種極具潛力的害蟲防治工具(Burand and Hunter, 2013; Mamta and Rajam, 2017)。目前RNA農藥的應用方式主要是宿主誘導型基因沉默(Host-induced gene silencing, HIGS)、病毒誘導型基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)和噴施誘導型基因沉默(Spray-induced gene silencing, SIGS)(Christiaensetal., 2020)。喂食、經皮給藥和灌溉是常用的噴施誘導型基因沉默的方式,并且具有較高的實用性(Ghoshetal., 2018; Jogaetal., 2016; Werneretal., 2020)。隨著RNAi應用理論的提出,越來越多的提高dsRNA在蟲體的傳遞效率和維持dsRNA穩定性的方法得到了充分的發展。例如使用納米載體包裹dsRNA以提高傳遞效率(Yanetal., 2021)、對dsRNA進行化學修飾以提高其在環境中的穩定性(Kurreck, 2003)。除了制劑的制備方法的研發,在RNA農藥與其他生物農藥的混合應用方面也進行了試驗。例如,將表達了dsRNA的細菌與蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)毒素混合(Kimetal., 2015),以及dsRNA與植物源農藥混合(Cenetal., 2020)處理害蟲,皆提高了生物農藥的殺蟲效率。

dsRNA可以在實驗室通過體外轉錄試劑盒合成,這種方法可獲得較純且較高濃度的dsRNA,但dsRNA的生產成本過高。使用細菌體系來生產大量的dsRNA,生產成本較低。這類農藥可用于直接喂食給靶標害蟲(Tianetal., 2009; Zhuetal., 2016),或者提純后對靶標害蟲進行噴施(Yanetal., 2019),這些dsRNA施用方式皆能有效防治害蟲。利用細菌體系生成dsRNA是通過將靶標分子的序列構建進入L4440載體、進而轉化進入大腸桿菌來實現的(Timmons and Fire, 1998)。然而,如何利用細菌生產大量的dsRNA、以及如何實現大量提取dsRNA仍值得探究。有報道指出通過超聲波破碎和加熱細菌獲得dsRNA(Ahnetal., 2019),但是超聲波和加熱的不穩定性對dsRNA片段的完整性有所影響。為此,本研究將對如何有利于dsRNA從細菌細胞中釋放這一環節進行實驗,探究提高dsRNA的提取量的方法。

利用RNA農藥進行害蟲防治的關鍵是所選靶標分子的有效性。蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)是一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT主要參與調控細胞大小和周期、葡萄糖代謝、基因組穩定性、基因轉錄和蛋白質合成等生理生化過程(Bellacosaetal., 1995; Bellacosaetal., 2005)。因此,AKT是細胞生命活動與生存的重要調控因子。在本研究中,選用針對褐飛虱蛋白激酶B(NlAKT)基因的dsRNA(dsNlAKT)作為探究細菌誘導生產條件的對象,構建了L4440-dsNlAKT重組質粒,提取NlAKTdsRNA的方法,為通過細菌體系大規模生產RNA農藥的方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細菌LB培養基配方如下:胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g和氯化鈉10 g。稱取這些物質溶于去離子水后,于容量瓶中定容至1 000 mL,高溫高壓滅菌后于4℃保存。

L4440質粒與大腸桿菌HT115(DE3)均為實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1L4440-dsNlAKT重組質粒的構建

基于NlAKT(NCBI基因庫中的基因號:XM_022345227.1)的催化結構域設計dsNlAKT,dsNlAKT的長度為172 bp。以褐飛虱cDNA為模板擴增得到NlAKT片段,引物如表1所示。PCR程序為:95℃預變性3 min;95℃變性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸10 s,擴增循環數為35,72℃補齊延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物,并利用凝膠回收試劑盒(天根,北京)回收并純化上述PCR產物后,連接于pMD-18t載體(Takara,大連),次日轉化到大腸桿菌DH5α中,提取NlAKT-18T質粒于-20℃保存直至使用。將所提取質粒送至北京擎科生物科技公司測序驗證。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

使用限制性核酸內切酶SacⅠ和HindⅢ雙酶切L4440載體和NlAKT-18T重組質粒。隨后使用T4連接酶(Takara,大連)將已切割好的NlAKT和L4440載體進行連接,16℃過夜,接著轉化到大腸桿菌HT115(DE3)中。于37℃、180 rpm培養1 h后,將轉化產物涂在含有氨芐青霉素(100 μg/mL)和四環素(12.5 μg/mL)的LB瓊脂培養平板上,37℃培養過夜。采用菌落PCR法篩選陽性菌落。將選定的菌落中分離的質粒進行測序驗證,隨后吸取800 μL菌液和200 μL甘油在1.5 mL離心管中,輕微混勻后-80℃保存直至使用。

1.2.2含NlAKT-L4440重組質粒的菌液的dsRNA表達的誘導將含有NlAKT-L4440重組質粒的大腸桿菌HT115按照1∶1 000的比例添加至含氨芐青霉素(100 μg/mL)和四環素(12.5 μg/mL)的LB液體培養基中(20～1 000 mL),220 rpm和37℃振蕩培養過夜活化。次日,從過夜培養的培養基中吸取菌液,按照1∶100的比例加到20 mL上述相同抗生素的培養基中。在37℃和220 rpm條件下培養至指數生長期(Log OD600 nm≈0.4)時,按照1∶1 000的比例加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),使其工作濃度為0.1 mM。然后在相同條件下再培養4 h。為探究最佳的IPTG誘導濃度,分別設置工作濃度為0、0.1、0.5和1.0 mM的IPTG誘導細菌。同時在0.1 mM IPTG條件下設置4個不同時間的誘導處理,為探究最佳的誘導時間,誘導時間分別為2、4、6和8 h。每次設置3個生物學重復。

1.2.3少量菌體的RNA提取

將20 mL誘導后菌液的細菌在2 mL離心管中4℃和12 000 rpm條件下離心收集。棄上清后,向菌體中加入1 mL Trizol試劑(艾科瑞,湖南)振蕩混勻冰上放置5 min,后加入200 μL氯仿:異戊醇(24∶1)(廣州化學試劑廠),劇烈震蕩混勻后置冰上10 min。于4℃和12 000 rpm條件下離心15 min后,將最上清液體轉移至新的離心管中,加入與上一步所轉移液體等體積的異丙醇(廣州化學試劑廠)并混勻。于-20℃放置2 h,于4℃和12 000 rpm離心20 min后棄去上清,向沉淀中加入1 mL 75% DEPC-乙醇洗滌,于8 000 rpm再離心2 min,棄上清后重復洗滌步驟。待RNA沉淀風干后加入DEPC-H2O溶解。

1.2.4大量菌體的RNA提取

將1 L誘導后菌液離心收集至40 mL耐高速離心管(Themo fisher,美國),于10 000 rpm條件下離心1 min。去上清液后,加入10 mL Trizol(艾科瑞,湖南)并混勻,置冰上孵育10 min,再加入4 mL氯仿∶異戊醇(24∶1)(廣州化學試劑廠)后劇烈震蕩混勻后,于冰上放置10 min,10 000 rpm條件下離心20 min。吸取上清,并向上清中加入等體積的異丙醇(廣州化學試劑廠),放置于-20℃沉淀2 h,于10 000 rpm離心25 min,棄去上清,向沉淀中加入5 mL 75% DEPC-乙醇,10 000 rpm離心5 min后棄去上清。待RNA沉淀風干后用5 mL DEPC-H2O溶解RNA。為探究溶菌酶預處理對RNA提取產量的影響,在收集誘導菌體并棄上清后加入10 mL溶菌酶(麥克林,上海)并混勻,溶菌酶最終的工作濃度為2 000 μg/mL。室溫下孵育10 min后再加入Trizol進行后續提取。

1.2.5單鏈RNA的消化

消化單鏈RNA的條件與操作嚴格參照T7 RNAi Transcription Kit(諾唯贊,南京,TR102-01)說明書的要求。消化完成后使用NanoDrop 2000單位分光光度計(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)測定RNA含量。

1.2.6數據統計

使用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行數據分析,并以平均值±SD表示。使用單程方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較來計算,多組比較的顯著性水平為P<0.05。對于處理后的樣本和對照組之間的比較,使用獨立樣本的t檢驗,顯著性水平為P<0.05(*),P<0.01(**)和P<0.001(***)。

2 結果與分析

2.1 L4440-dsNlAKT載體的構建與dsNlAKT表達

靶標分子的dsRNA需要經過大規模生產方能應用,為此,本研究利用細菌體系進行生產條件的試驗。根據褐飛虱基因組中的NlAKT序列,通過RT-PCR,獲得了172 bp褐飛虱NlAKTcDNA,連接到pMD-18T載體后,通過Sac Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制性核酸內切酶,將NlAKT構建進入L4440載體(圖1-A)。因此合成的dsRNA將加上185 bp多克隆位點的片段,總dsNlAKT長度為250 bp。將該載體轉化進入HT115(DE3)菌株后,進行dsRNA誘導表達。IPTG激活T7啟動子而生成了250 bpdsNlAKT片段,當用RNase A消化去除樣品中細菌本身的低分子量RNA后,dsNlAKT條帶清晰可見(圖1-B)。

圖1 dsNlAKT-L4440表達載體構建示意圖(A)和誘導dsNlAKT結果凝膠電泳圖(B)Fig.1 Construction of dsNlAKT-L4440 expression vector (A) and dsNlAKT gel electrophoresis (B)注:M,2000 DNA marker;1,含L4440空質粒的HT115菌株的誘導產物;2,含dsNlAKT-L4440的HT115菌株的誘導產物;3,經RNase A消化后的含L4440空質粒的HT115菌株的誘導產物;4,經RNase A消化后的含dsNlAKT-L4440的HT115菌株的誘導產物。Note: M, 2000 DNA marker; 1, IPTG induction of bacterial HT115 (DE3) containing L4440 expression vector; 2, IPTG induction of bacterial HT115 (DE3) containing L4440- dsNlAKT expression vector; 3, IPTG induction product of bacterial HT115 (DE3) containing L4440 expression vector digested by incubation with RNase A; 4, IPTG induction product of bacterial HT115 (DE3) containing L4440- dsNlAKT expression vector digested by incubation with RNase A.

2.2 不同IPTG濃度對dsRNA產量的影響

為了探究最佳dsRNA產量的誘導條件,對IPTG的劑量進行了試驗。當分別用工作濃度為0、0.1、0.5和1.0 mM的IPTG去誘導L4440載體的T7啟動子啟動轉錄時,對比誘導后細菌的總RNA濃度發現IPTG工作濃度在0.1～1 mM范圍內對總RNA的產量無明顯影響(圖2-A)。然而,細菌體系生成的dsRNA包含了細菌的RNA(圖1),為了明確體系中的dsRNA的生成是否與IPTG濃度有關,采用核酸酶(RNase A)對產物中的單鏈RNA進行消除。結果表明,IPTG工作濃度為0.1和0.5 mM時,處理組中的dsNlAKT條帶明顯比工作濃度為1 mM的處理組更亮(圖2-B)。這些結果表明,盡管用分光光度計測定的總RNA濃度不受IPTG的濃度影響,但實際上,dsRNA的誘導量是有差異的,低濃度(0.1～0.5 mM)IPTG有助于dsRNA生產。

圖2 不同IPTG濃度對dsNlAKT生成的影響分析Fig.2 Analysis of the effect of different IPTG concentrations on dsNlAKT generation注:A,不同濃度IPTG對含dsRNA的細菌體系中總RNA濃度的影響;B,不同濃度IPTG誘導和RNase A消化的產物電泳圖;M,2000 DNA marker;1,0.1 mM IPTG誘導并經RNase A消化的產物;2,0.5 mM IPTG誘導并經RNase A消化的產物;3,1 mM IPTG誘導并經RNase A消化的產物。Note: A, Effect of different concentrations of IPTG on the total RNA concentration in the bacterial system containing dsRNA; B, Electropherogram of products induced with various concentrations of IPTG and digested by RNase A; M, 2000 DNA marker; 1, 0.1 mM IPTG-induced and RNase A-digested product; 2, 0.5 mM IPTG-induced and RNase A-digested product; 3, 1 mM IPTG-induced and RNase A-digested product.

2.3 不同IPTG誘導時間對dsRNA產量的影響

在確定了最佳IPTG誘導濃度后,本研究對IPTG的誘導時間進行了試驗。選擇了最低的IPTG濃度0.1 mM進行實驗。結果表明,搖菌獲得的細菌總RNA濃度在IPTG誘導的前4 h沒有明顯的變化,但在4～8 h之間時,產量會隨著時間的增加而顯著增加(圖3-A)。為了探究這一時間段的RNA顯著增加是否是dsRNA產量的增加所致,將這4個誘導時間點的RNA產物用核酸酶進行單鏈RNA的消除,發現誘導時間為6 h的處理組dsNlAKT的條帶最亮(圖3-B)。這些結果表明采用0.1 mM IPTG誘導6 h的生產條件有助于最大化生成dsNlAKT。

圖3 不同IPTG誘導時間對dsNlAKT生成的影響分析Fig.3 Analysis of the effect of different IPTG induction times on dsNlAKTgeneration注:A,不同IPTG誘導時間對細菌體系中誘導產物總RNA濃度的影響;B,不同IPTG誘導時間誘導并經RNase A消化的產物電泳圖;M,2000 DNA marker;1,IPTG誘導2 h并經RNase A消化的產物;2,IPTG誘導4 h并經RNase A消化的產物;3,IPTG誘導6 h并經RNase A消化的產物;4,IPTG誘導8 h并經RNase A消化的產物。Note: A, Effect of different induction times on the total RNA concentration of the induced products in the bacterial system containing dsRNA; B, Electropherogram of products induced with various time by IPTG and digested by RNase A; M, 2000 DNA marker; 1, Products induced by IPTG for 2 h and digested by RNase A; 2, Products induced by IPTG for 4 h and digested by RNase A; 3, Products induced by IPTG for 6 h and digested by RNase A; 4, Products induced by IPTG for 8 h and digested by RNase A.

2.4 添加溶菌酶對dsRNA提取量的影響

dsRNA在菌體中被誘導生成后,需要從細胞中游離出來并提取以應用。為了減少儀器設備的使用,采用低劑量的溶菌酶進行預處理,使dsRNA從細胞中游離出來,再采用常規Trizol方法提取RNA。同時采用常溫離心機取代低溫離心機提取RNA,以利于生產。實驗結果表明,添加溶菌酶進行預處理所獲得的總RNA量比僅用Trizol方法的有所增加(圖4-A)。由于溶菌酶的處理同時增加了dsRNA和細菌本身的RNA的量,為此,對溶菌酶處理后的dsRNA進行測定。經過核酸酶的處理后,進行了RNA總濃度的測定。結果表明,添加溶菌酶預處理的總RNA濃度同樣比未添加溶菌酶預處理的對照組高1.2倍(圖4-B)。RNase A消化后的提取產物的電泳結果顯示,增加了溶菌酶預處理的處理組的dsNlAKT條帶也明顯地比未添加溶菌酶預處理的對照組更亮(圖4-C)。這說明在提取RNA前添加溶菌酶的預處理有助于提升提取產物中dsNlAKT的含量,且不影響dsRNA的完整性。

圖4 添加溶菌酶預處理對提取產物中dsRNA含量的影響Fig.4 Effect of lysozyme pretreatment on the extraction amount of dsRNA注:A,添加溶菌酶預處理與僅使用Trizol提取獲得的產物總RNA含量比較;B,經RNase A消化的添加溶菌酶預處理與僅使用Trizol提取獲得的產物總RNA含量比較;C,經RNase A消化的添加溶菌酶預處理與僅使用Trizol提取獲得的產物凝膠電泳圖;M,2 kb DNA Marker;1,RNase A消化后的Trizol法提取產物(無溶菌酶預處理);2,RNase A消化后的Trizol法提取產物(溶菌酶預處理)。Note: A, Quantity comparison of dsRNA obtained by adding lysozyme pretreatment and Trizol method only; B, Quantity comparison of dsRNA obtained by adding lysozyme pretreatment and Trizol method only and digested by RNase A; C, Gel electrophoresis of dsRNA obtained by adding lysozyme pretreatment and Trizol method only and digested by RNase A; M, 2 kb DNA Marker; 1, RNA extraction using Trizol method; 2, RNA extraction using Trizol method after pretreatment with lysozyme.

3 結論與討論

RNA農藥相比于傳統的化學農藥有著高效、特異性強、易降解的優勢而具備巨大的應用前景(Burand and Hunter, 2013; Mamta and Rajam, 2017)。建立大規模生產體系、提高農藥有效成份的產量和降低生產成本是當前RNA農藥推廣應用的前提。通過L4440質粒配合大腸桿菌體系是當前能夠以較低成本實現大規模生產dsRNA的方法(Newmarketal., 2003; Ongvarrasoponeetal., 2007)。本研究以dsNlAKT為研究對象,構建了L4440-dsNlAKT載體,探究了不同誘導條件對產量的影響。研究結果表明采用工作濃度為0.1 mM和0.5 mM IPTG所誘導的dsRNA產量高于1 mM IPTG所誘導;0.1 mM IPTG 處理4～8 h范圍內,總RNA產量隨著誘導時間的增長而顯著增加,但處理6 h時dsNlAKT產量最高。此外,還證明了添加低劑量的溶菌酶進行預處理有助于菌體充分裂解,進而增加了產物中dsRNA的含量。

L4440載體配合RNase III缺陷的大腸桿菌株系最早在1998年被用于生產dsRNA (Timmons and Fire, 1998)。這一體系已被廣泛用于生產針對不同害蟲的靶標基因的dsRNA,并獲得了顯著的基因敲除效果(Ganbaataretal., 2017; Mengetal., 2020; Zhangetal., 2013)。本研究利用了其中的Sac Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點構建了L4440-dsNlAKT載體(圖1-A),并獲得了大小符合預期的dsNlAKT(圖1-B)。

產量和成本是工業化大規模生產dsRNA的所需考慮的重要因素。確定dsRNA誘導的最佳條件是保障dsRNA生產的基礎。Ahn等人認為細菌體系生產dsRNA在2～10 h內產量與誘導時間呈正相關,而在固定誘導時間的前提下,0.1～3 mM濃度范圍的IPTG對dsRNA的產量無明顯影響(Ahnetal., 2019)。為了確定具體的最佳誘導條件,以滿足生產的要求,本研究選用了低濃度的純度大于或等于98%的工業級IPTG,在確定能夠誘導出目的片段并且完整性良好(圖1-B)的情況下,進行了誘導條件的測試。通過細菌體系總RNA和核酸酶消化細菌的單鏈RNA后的dsRNA含量測定,發現雖然dsRNA的產量在IPTG誘導2 h后增加,但以6 h的誘導時間為最佳(圖3),而時間延長后,dsRNA的產量有所下降。IPTG濃度對dsRNA的產量的影響不及誘導時間的大,但發現IPTG工作濃度在0.1～0.5 mM范圍內對dsRNA產量誘導作用大于1 mM的(圖2),因此,在前人的工作基礎上進行了具體生產條件的確定,本研究確定了0.1 mM IPTG搖菌培養6 h可以獲得較高的dsRNA的產量的條件,對采用低濃度IPTG進行dsRNA生產提供了實驗數據。

Trizol作為一種常用的RNA抽提劑能夠從細胞或組織中提取總RNA。同樣,Trizol也適用于細菌的總RNA提取(Rioetal., 2010)。HT115細菌是大腸桿菌針對dsRNA生產的改造品系,屬于革蘭氏陰性菌,其細胞壁由肽聚糖和脂質組成,這一細胞壁結構可能會降低Trizol對菌體的裂解效率(Rani and Patri, 2019)。溶菌酶能水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰基-D-葡糖胺殘基間的β(1→4)鍵(Choietal., 2012)。Villa-Rodríguez等人曾設計實驗探究了溶菌酶對于增加提取一種革蘭氏陽性菌RNA產量的作用,結果證明在溶菌酶的幫助下,能夠彌補Trizol在裂解細菌時的不足從而增加RNA產量(Villa-Rodriguezetal., 2018)。針對1 mL對數生長期的革蘭氏陰性菌菌體量的溶菌酶常用工作濃度為400 μg/mL(生工,上海)。考慮到大規模生產的成本,本研究將1 mL對數生長期的革蘭氏陰性菌菌體量的溶菌酶常用工作濃度降低為2 μg/mL(為推薦劑量的1/200倍)。結果發現即使大幅降低了溶菌酶的使用量,在提取大腸桿菌中dsRNA前進行溶菌酶預處理,相比于不添加溶菌酶處理的對照組,增加了總RNA產量(圖3-A)。對RNase A消化后產物的RNA濃度測定也證明RNA比對照組發生了顯著的增加(圖3-B),凝膠電泳結果也證明了溶菌酶預處理增加dsRNA提取量并保持其完整性(圖3-C)。因此,本研究提供了提高dsRNA提取量的低劑量溶菌酶處理方法。

綜上所述,本研究通過構建基于大腸桿菌HT115的dsNlAKT生產體系的載體,采用常溫取代低溫條件和儀器,以及對dsRNA生產條件的優化,初步獲得了可用于dsRNA生產的條件。所獲得的dsRNA生產條件如下:(1)使用工作濃度范圍為0.1～0.5 mM的IPTG對dsRNA的產量無明顯影響,當IPTG工作濃度增加至1 mM時會降低dsRNA的產量。因此,可使用最低劑量0.1 mM的工業級IPTG進行dsRNA生產;(2)IPTG誘導時間為2～8 h的范圍內,dsRNA產量皆有所增加,但0.1 mM IPTG誘導6 h的條件有利于dsRNA的產量最大化;(3)對菌體進行工作濃度為2 μg/mL溶菌酶的預處理有助于dsRNA提取量的增加。這些結果為大規模通過細菌體系生產RNA農藥提供了實驗依據。