基于近紅外光譜法快速同時測定天麻中4種成分含量的研究*

司凱元，嚴春榮，黃艷萍，孔德濤，楊晶晶，王羚航，劉祥義，侯 英**

(1.西南林業大學，云南 昆明 650224；2.玉溪市質量技術監督綜合檢測中心，云南 玉溪 653100)

天麻(GastrodiaelataBl.)又名赤箭、定風草、離合草等，為蘭科天麻屬真菌異養型多年生草本植物，以加工后的干燥塊莖入藥[1]。天麻被廣泛應用于醫藥、保健品和滋補食品領域，具有較高的研究價值[2]。天麻中含有多種成分，通常天麻素和對羥基苯甲醇等酚類化合物被認為是天麻的主要成分，在2020年版《中國藥典》(一部)[3]中規定以天麻素和對羥基苯甲醇含量為指標來評價天麻質量。巴利森苷類是由對羥基苯甲醇及其衍生物與檸檬酸聚合而成，其不僅含量高，且衍生產物多樣，并具有改善記憶、抗抑郁等藥理作用，也是天麻中一類重要的化學成分[4]。目前多采用高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜法等方法來測定天麻中主要成分[5-6]。鑒于中藥材和中藥飲片具有批次規模較小，質量受產地因素影響大，不同批次間主要成分含量差異大等特點，因此開發可用于現場測定的低成本、簡單、快速的檢測方法，成為提高中藥材、飲片監管和檢測效率的關鍵。

近紅外光譜法是近年來分析化學領域發展較為迅速的光譜分析方法，已成熟應用于農業、制藥、食品、石化和煙草等領域[7-8]的產品質量控制中。目前，應用近紅外光譜技術對中藥材和中藥飲片進行定性和定量的研究已有相關報道。何淑華等[9]對吉林人參進行定性分析；李國輝等[10]對栽培和野生中藥材燈盞花進行鑒別；李勁等[1]應用近紅外光譜技術對小柴胡顆粒中的黃芩苷含量進行測定；趙艷麗等[12]應用近紅外光譜快速鑒別不同產地藥用植物重樓。但近紅外光譜分析技術用于天麻中同時測定多種成分的報道較少。本研究收集116份不同產地的天麻樣品，采用HPLC和HPLC-MS-MS法分別測定天麻中天麻素和對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B含量，并結合樣品的近紅外光譜，采用TQ 8.6分析軟件分別建立天麻中4種成分的定量模型并采用外部驗證對模型進行評價。相較于傳統的高效液相色譜法測定，近紅外光譜法快速測定天麻中4種主要成分的方法具有快速、準確、無損和綠色的優勢，具有較好的實用性和推廣應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采集2021—2022年采收的不同產地天麻樣品116份，經西南林業大學劉祥義教授鑒定為天麻干燥塊莖，樣品來源信息詳見表1。以96個樣品作為校正集，以優化和建立天麻中4種成分的定量模型。以20個樣品作為驗證集，以驗證所建立校正模型的預測能力。

表1 樣品來源信息

1.2 設備與材料

Antaris Ⅱ 近紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技，漫反射模塊，Result 2.1軟件采集光譜圖、TQ 8.6軟件定量分析)；1290 Infinity高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；SIMCA-P+11.0軟件(瑞典UMETRICS公司)；UltiMate 3000-TSQ FOPTIS高效液相-三重四級桿質譜儀(配ESI離子源)(美國Thermo公司)；DFT-100型中藥粉碎機(浙江溫嶺市林大機械有限公司)；0.25 mm 不銹鋼篩子(中西泰安公司)。

天麻素(>98%，批號：P1922434)和對羥基苯甲醇(>98%，批號：P2124258)購自上海泰坦科技股份有限公司；巴利森苷(>98%，批號：7857)購自上海詩丹德標準技術服務公司；巴利森苷B(>98%，批號：DST190901-063)購自成都德思特生物技術有限公司；乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；水為超純水。

1.3 樣品的制備

供試天麻樣品采集后用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗3次，將其切成薄片，隔水蒸制 15 min 后，常溫下陰干，用中藥粉碎機粉碎過 0.25 mm 篩。粉末樣品量不少于 50 g，存放于自封袋中備用。

1.4 天麻4種成分的測定

天麻中天麻素和對羥基苯甲醇的含量測定按照《中華人民共和國藥典》2020年版一部[4]天麻項下的含量測定進行。天麻中巴利森苷和巴利森苷B含量測定參考康傳志[6]等的方法進行。

1.5 近紅外光譜數據采集

采集樣品近紅外光譜前，將粉末狀的天麻樣品置于恒溫恒濕箱中平衡 24 h，平衡樣品水分含量在10%～12%之間。在近紅外光譜儀器預熱 2 h 后，使用Result 2.1軟件漫反射模塊采集天麻樣品的近紅外光譜。

稱取平衡水分后的天麻樣品 20 g，置于近紅外采樣杯中，壓緊。近紅外光譜采集條件為：掃描次數為64次，分辨率為 4 cm-1，掃描范圍為 10000～4000 cm-1。每個樣品平行測定3次，取平均光譜作為樣品光譜，進行數據建模。

天麻樣品的樣品原始近紅外光譜圖見圖1，從圖中可看出，不同樣品的近紅外光譜圖差異較小，僅在部分波段的吸收強度上有微小差異，需經一定預處理過程以提取特征信息。原始光譜經處理后的二階導數光譜圖見圖2所示。

圖1 天麻樣品的NIRS原始光譜

圖2 天麻樣品的NIRS二階導數光譜

1.6 近紅外光譜數據處理

不同化學成分的近紅外吸收主要與其化學結構有關，其吸收峰所含化學信息僅與某些特定波段關系密切。由于全波段光譜中不僅包含待測成分信息，還包含大量冗余信息，因此建模波段的準確選擇對模型的建立十分關鍵。近紅外光譜分析是從復雜、重疊、變動的背景中提取信息，在建立近紅外校正模型時，對近紅外光譜進行一系列預處理來放大信號，濾除噪音等處理，并選擇合適的譜區及其他合適的參數。一般消除近紅外光譜的旋轉或者漂移造成的影響可以利用導數給與校正[13 ]。

采用TQ 8.6軟件對采集的天麻樣品光譜進行方差光譜分析，選取光譜方差較大的光譜段(7500～6900 cm-1和6100～4050 cm-1)作為天麻特征信息識別的原始變量，消除光譜的冗余信息，結果見圖3所示。

圖3 標準偏差選擇特征光譜波段

2 結果與分析

2.1 校正模型建立

應用TQ Analyst 8.6光譜數據處理軟件對樣品的近紅外漫反射光譜進行分析處理，將樣品的近紅外光譜分別與樣品中素天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B的含量數據一一對應，采用偏最小二乘法(PLS)建立了測定天麻中4種成分的校正模型。4種成分的校正模型預測值與對應高效液相色譜法測定值之間的相關圖見圖4所示。

A.天麻素(gastrodin)B.對羥基苯甲醇(4-hydroxybenzyl alcohol)C.巴利森苷(parishin)D.巴利森苷B(parishin B)圖4 NIR校正模型預測值與真實值之間相關圖

用校正模型的相關系數R2、校正標準誤差(SEC)和均方預測殘差(SECV)對建模效果進行評價，相關系數R2越接近1則校正模型的預測準確性越高，天麻中4種成分的建模效果及校正模型參數如表2所示。由表2可知，天麻素、巴利森苷和巴利森苷B的近紅外校正模型相關系數大于0.92，而對羥基苯甲醇的為0.8950，說明近紅外光譜法測定具有相對較好的準確性。校正標準誤差(SEC)和均方預測殘差(SECV)的值越小，說明預測的誤差越小，且兩者的值越接近則表明模型過擬合的可能性越小。由表2可知，4種成分的近紅外校正模型均不存在過擬合的風險，具有較好的穩定性。

表2 天麻中4種成分的NIRS校正模型參數

2.2 校正模型的外部驗證

采用20個驗證集樣品分別對天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B的校正模型進行外部驗證，4個成分的20個驗證集樣品的預測均方根誤差(PMRE)分別為3.52%，5.27%，3.77%和3.81%。將20個驗證集樣品的模型預測結果與高效液相色譜法測定結果進行配對t檢驗(顯著水平α=0.05)，結果表明兩種測定方法的測定結果無顯著差異。校正集模型參數和外部驗證結果均表明所建立的天麻中天麻素、對羥基苯甲、巴利森苷和巴利森苷B的近紅外模型具有預測穩定性和準確性。

2.3 校正模型的應用

用所建立的近紅外預測模型對不同產地的待測天麻樣品進行測定，結果見表3，從表中測定結果可知，中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B這4種成分含量存在差異。

表3 不同產地天麻中4種成分的含量 (mg/g)

3 結論

本文采用近紅外光譜(NIRS)技術結合偏最小二乘法(PLS)建立了同時定量測定天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B含量的快速檢測方法，所建立的近紅外光譜預測模型具有相關較好的預測穩定性和準確性，可用于天麻中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B素含量的快速測定。