復方紫云膏制備工藝的優化及質量評價

王一帆，熊 雄，李 皓，陳 婷**

(1.昆明醫科大學 藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院藥劑科，云南 昆明 650032；3.大理大學藥學院，云南 大理 671003)

醫院制劑是對藥品市場的補充與完善，由醫院制劑室依據制劑規范或處方來制備供醫院臨床使用而市場無銷售的一種特殊制劑[1]，其特點是自配、自用、價廉，具有周期性并且藥品的不良反應較少，費用低。醫院制劑大多是基于中藥處方，有散劑、膏劑、水丸、蜜丸等劑型，方便使用，更容易被患者接受[2]。

軟膏劑攜帶方便，使用便捷，能夠提高患者用藥的依從性[3]。基質作為藥材的載體，對藥物有釋藥性，穩定性，透皮性[4]。復方紫云膏采用油性基質，性質穩定，不會易發生變質，涂布于皮膚上形成密閉的油膜，軟化皮膚使其柔軟，不易與水融合。此外軟膏的質量標準也是一個值得探討的問題，一般的軟膏要考慮外觀性狀、延展性、穩定性、刺激性，但對于嚴重創傷或臨床要求無菌的軟膏需要進行無菌檢查。

復方紫云膏又稱紫草軟膏，是一種中成藥。在《外科正宗》[5]中有記載潤肌膏，主要由麻油、紫草、當歸組成，可用于養血、涼血、潤燥，可治禿瘡、白屑、頭皮干枯瘙癢等癥狀。而該醫院復方制劑的處方由紫草、白芷、冰片、蜂蠟、麻油組成，有清熱解毒、涼血止痛的作用。用于I、II度燒傷、燙傷、濕疹、手足癬等癥狀[6-8]。其中紫草作為君藥，含有大量的萘醌類色素和多糖類化合物，藥用成分的萘醌類色素包括左旋紫草素、β，β-二甲基丙烯酞紫草素、紫草素、乙酰紫草素等[9-11]，具有活血消腫、去腐生肌、解毒透疹的作用，依據現在臨床藥理學研究，紫草的有效成分有抗炎止痛、抑菌抗病毒、抗腫瘤、免疫調節作用、護肝、促凝血以及抑制前列腺素合成等作用[12-14]，但目前臨床上主要用于皮膚方面的疾病。白芷為臣藥，根據所查文獻白芷在復方制劑中主要是對濕熱之癥活血排污，治療皮膚風邪濕熱所引起的瘙癢[15]。冰片為使藥，氣清香，能透過皮膚屏障，使藥物能夠到達病癥場所，發揮最大的藥效。麻油和蜂蠟作為該處方中的油性基質，麻油具有生肌潤膚，能緩解濕疹濕瘡，富含維生素E，可抗氧化防治藥液霉變；蜂蠟有一定的解毒作用，讓膏體能在一定時間內快速定型，保持膏體的穩定性，對皮膚無刺激性[8，16，17，18]。

復方紫云膏中紫草的提取方法有很多，如醇提法、油炸法、油浸法、水煮法。本文所研究的提取方法就是采用油炸法[19]，方法簡便快捷能滿足醫療的需求。本文主要采用正交實驗設計，以左旋紫草素含量為指標，優選出最佳的工藝方案來提高紫草素的含量，并對其軟膏劑進行鑒別、含量測定、穩定性、均勻性、微生物限度檢查[20-21]，保障質量，降低成本，提高收率。

1 試驗材料

1.1 實驗儀器

UV5紫外分光光度計(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司)、KQ-50E型超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)、DF-1012焦熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海力辰邦西儀器科技有限公司)、溫度計。BP121S型分析天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司)、ME5502型天平(梅特勒托利多儀器(上海)有限公司)、HR30-IIA2型生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)、JB-CJ-1000FC型潔凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)、HPX-9082MBE型電熱恒溫培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)、MSL.N型壓力蒸汽滅菌鍋(威海威高海盛醫用設備有限公司)。

1.2 試藥和試液

紫草(批號：01-2130101，廠家：安徽芙蓉)；白芷(批號：01-21020102，廠家：安徽毫州)；冰片(批號：200612，廠家：云南林緣香料)；蜂蠟(批號：F210102，廠家：河北徐氏蜂蠟)；麻油(批號：20220323，廠家：云南華輝盛糧油)；左旋紫草對照品(批號：200405，廠家：中國藥品生物制品檢定研究院)；無水乙醇(批號：20220221，廠家：廣東光華科技股份有限公司)；乙酸乙酯 (批號：1606101，廠家：上海申博化工有限公司)；石油醚(批號：200904，廠家：西隴科學股份有限公司)；香草醛(批號：C11695287，廠家：麥克林)；濃硫酸(批號：202101101，廠家：重慶川東化工)；氫氧化鈉(批號：202101101，廠家：重慶川東化工)；鹽酸(批號：202101101，廠家：重慶川東化工)；冰片對照品(批號：200303，廠家：中國藥品生物制品檢定研究院)；復方紫云膏(批號：220409、220410、220411)。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌(批號：G0042DX，廠家：廣東黃凱微生物有限公司)、銅綠假單胞菌(批號：G0055DX，廠家：廣東黃凱微生物有限公司)、大腸埃希菌(批號：G0039DX，廠家：廣東黃凱微生物有限公司)。

1.4 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號：1096841)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：1105961)、胰酪大豆胨液體培養基(批號：1106141)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(批號：1105961)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基(批號：1081171)、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：317N031)，以上材料均來自廣東黃凱微生物有限公司。培養基的適用性檢查和控制菌檢查的適用性符合2020版《中國藥典》(四部)。

2 方法

2.1 現復方紫云膏制備工藝

將麻油升溫至 120 ℃ 加入蜂蠟使其熔化，加入白芷，調至文火并維持此溫度待至白芷焦黃，加入紫草，繼續用維持微火加熱，然后置于恒溫箱中浸漬時間，趁熱用四層紗布濾過，等冷卻至 50 ℃ 左右，加入冰片攪拌至冷即可。

2.2 復方紫云膏中左旋紫草素含量測定

按照《中國藥典》2020版一部中紫草項下含量測定，使用紫外分光光度計測定羥基萘醌總色素的含量，并以左旋紫草素記。

2.2.1 標準曲線的制備

精密稱取左旋紫草素對照品 5 mg 置于 50 mL 容量瓶中，加入無水乙醇稀釋定容，搖勻。分別取 1、2、3、4、5 mL 于 25 mL 的量瓶中，加無水乙醇稀釋定容，搖勻。然后根據左旋紫草在 519 nm 處有紫外吸收，以無水乙醇作為空白對照，分別測定上述溶液的吸光度，并以吸光度為縱坐標，左旋紫草素濃度為橫坐標繪制出標準曲線并考察線性關系。結果見圖1。

圖1 標準曲線

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱定供試品 1 g，置于三角瓶中，精密量取無水乙醇 50 mL，超聲溶解，在冰箱內冷藏過夜，搖勻，過濾，即得。

2.2.3 供試品的含量測定

照紫外分光光度法，在 519 nm 處測定供試品的吸光度，并將吸光度帶入標準曲線內，計算出復方紫云膏的含量，按左旋紫草素(C16H16O5)的吸收系數(E1% 1 cm)為242計算。

2.2.4 復方紫云膏中紫草素的含量計算公式

平均含量=(C1+C2)÷2

2.3 單因素實驗

根據處方先對文中的“文火微火維持此溫度”進行試驗，以110～90 ℃、120～90 ℃、130～90 ℃、140～90 ℃、150～90 ℃ 的起始溫度作為考察，然后又對提取工藝中單因素進行研究：以提取溫度(100、110、120、130、140 ℃)、提取時間(15、30、45、60、75、90 min)、 浸漬時間(0、6、12、18、24、30 h)分別進行實驗，考察3個因素對復方紫云膏中左旋紫草素的含量影響。

2.4 正交實驗

在單因素的基礎上以提取溫度、提取時間、浸漬時間為研究對象，擬定三因素三個水平，建立L9(34)的正交表，以9組提取條件進行實驗，見表1。

表1 L9(34)正交實驗水平表

3 實驗結果與分析

3.1 標準曲線

以左旋紫草素對照品的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得回歸方程式：y=0.0949x+0.0017，R2=0.9993線性關系較好，線性范圍為：0.004～0.020 mg/mL，見圖1。

3.2 單因素實驗結果

3.2.1 提取溫度對復方紫云膏中左旋紫草素的影響

根據處方提取溫度條件進行試驗，結果發現所測定的左旋紫草素的含量都沒有達到規范所要求的含量。當溫度為90～120 ℃ 時，含量是最高的但依舊沒有到達 1.3 mg/g，結果如圖2。

圖2 提取溫度(預實驗)

通過查閱文獻及預實驗，重新設置溫度。隨著溫度的升高，左旋紫草素含量逐漸的升高，在 130 ℃ 時含量達到最大值。但在 140 ℃ 以上隨著溫度的升高含量急劇降低，說明有效成份發生了改變，因此確定120～140 ℃ 作為設計水平，結果如圖3。

圖3 提取溫度

3.2.2 提取時間對復方紫云膏中左旋紫草素的影響

當提取時間在30～90 min 的范圍內左旋紫草素的含量高，結果如圖4，因此確定此時間段作為正交試驗分析的因素水平。

圖4 提取時間

3.2.3 浸漬時間對復方紫云膏中左旋紫草素的影響

隨著浸澤時間的增加，左旋紫草素的含量逐漸的增加，結果如圖5，確定6～24 h 的浸澤范圍為浸澤時間段進一步考察。

圖5 浸漬時間

3.3 正交試驗結果與方差分析

按照“1.5.1”和“1.5.2”中復方紫云膏的制備和測定方法，測定各項提取條件左旋紫草的含量，見表2。

表2 L(34)正交實驗設計和結果

由正交實驗表2知：從極差R可得出，影響復方紫云膏中左旋紫草素含量的主次因素為C>A>B，最佳的提取工藝方案是A2B2C3，即提取溫度 130 ℃、提取時間 1 h、浸漬時間 24 h。是根據藥學理論及經濟學，為了節約時間和成本，在實際應用時浸漬時間可選用 12 h。從方差分析表3可知浸澤時間和提取溫度的P<0.05，具有顯著性，為主要的影響因素；提取時間的P>0.05，無顯著性差異。

表3 方差分析表

3.4 驗證實驗

根據上述的提取條件，在潔凈間平行進行三次驗證性實驗，按照紫外分光光度法，供試品溶液的制備：照“2.2.2”，供試品溶液的含量測定：照“2.2.3 ”進行測定，實驗的結果如表4。

表4 驗證實驗結果

4 質量檢驗

4.1 檢驗項目

4.1.1 性狀

本品為紫紅色半固體，有清涼香氣。

4.1.2 鑒別

紫草的鑒別 分別取三批樣品約 2 g，加乙醇 5 mL，振搖，放置后液體顯紅色，加氫氧化鈉試液5滴，液體變為藍色，再加稀鹽酸使溶液呈酸性后，液體由藍變成紅，本項結論3批樣品中都含有紫草。

冰片的鑒別 分別取3批樣品約 20 g，進行微晶升華，得到的白色升華物后，加無水乙醇 1 mL 使其溶解搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取冰片對照品 10 mg，加無水乙醇 1 mL 制成每 1 mL 含 10 mg 的溶液，作為對照品溶液。按薄層色譜法，用毛細管吸取上述兩種溶液各 10 uL 分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-石油醚[沸程為60～90 ℃](2∶19)為展開劑，將薄層版放入展開缸中展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，本項結論三批樣品中都含有冰片。

4.1.3 含量測定

依據“3.3”的提取工藝條件，“2.1”制備方法制備3批藥品，按2.2.3項分別測定含量，結果如表4，質量分數都大于1.3(mg/g)。本項結論三批樣品符合質量要求。

4.2 微生物限度檢查

4.2.1 微生物計數

1)實驗準備：

培養基準備：按用量均以 121 ℃ 滅菌 15 min 備用。

試驗材料準備：均以 121 ℃ 滅菌 30 min 備用。

2)供試液制備：

從樣品中分別取 10 g，加入滅菌含 20 mL 的十四烷基異丙酯及玻璃珠的錐形瓶中，混勻，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100 mL 制成1∶10的供試液。

3)計數方法：

平皿法中的傾注法

4)陰性對照：

用無菌的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，照供試液同法進行操作，培養，計數。

5)凈化工作臺沉降菌動態檢測：

將4個胰酪大豆胨瓊脂平皿以無菌方式帶入操作室，在操作臺上下左右各放一個，在微生物限度檢查的同時，打開蓋子，放置后蓋好皿蓋，置30～35 ℃ 培養 48 h。統計平板上菌落數：上0個，左0個，下0個，右0個，平均0個。(應不超過1個)

6)表面微生物檢測：

將4個胰酪大豆胨瓊脂平皿以無菌方式帶入操作室。待試驗結束后，取2個瓊脂平皿，在操作臺左右各放一個，打開蓋子，培養基表面與操作臺直接接觸，均勻按壓接觸碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣點表面均勻充分接觸，接觸約 10 s，再將蓋子蓋上，置30～35 ℃ 培養 48 h。統計平板上菌落數：左0個，右0個，平均0個。(應不超過1個)

另取2個胰酪大豆胨瓊脂平皿，打開蓋子后，單手五指按壓培養基表面，確保手與全部瓊脂表面均勻充分接觸 10 s，再蓋上蓋子，雙手分別取后置置30～35 ℃ 培養 48 h。取出檢查，統計平板上菌落數：左0個，右0個，平均0個。(應不超過1個)

本項結論潔凈間的表面菌和沉降菌都符合要求。

7)培養與計數：

取上述供試液 1 mL 于無菌的平皿中，加入提前滅菌的胰酪大豆胨瓊脂培養15～20 mL，混勻，置于 35 ℃ 的培養箱中培養 5 d，觀察并計算菌落數。

取供試液 1 mL 于無菌平皿中，加入提前滅菌好的沙氏葡萄糖瓊脂培養基15～20 mL，混勻凝固，置于 25 ℃ 的培養箱中培養 7 d，觀察并計算菌落數。

另外取上述“(4)”陰性對照液同上述操作。結果見表5。

表5 微生物計數實驗結果

4.2.2 控制菌檢驗方法

根據《中國藥典》2020版四部通則1107規定，皮膚給藥制劑不得檢測出金色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

1)陽性對照組：

35 ℃ 連續培養 22 h 的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備成每 1 mL 含菌量不大于100cfu的菌液。取上述菌液 1 mL 加入 9 mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻后加入 100 mL 的胰酪大豆胨液體培養基在 35 ℃ 中培養18～24 h。

2)供試液組：

取“上述2.1.5.1中(2)”的溶液 10 mL，加入胰酪大豆胨液體培養基至 100 mL，制成1∶10供試液。

3)陰性對照組：

用稀釋液代替菌液進行制備方法同上。

4)增菌培養：

過程見表6。P(5)選擇和分離培養

表6 增菌培養

金色葡萄球菌：取上述增菌液劃線接種到甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，在 35 ℃ 的培養基中培養 24 h，觀察并判斷菌種。

銅綠假單胞菌：取上述增菌液劃線并接種到溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基，在 35 ℃ 的培養基中培養 24 h，觀察并判斷菌種。結果見表7。

表7 控菌檢查結果

由上可得3批復方紫云膏符合要求。

4.3 裝量差異

藥品在進行質量檢驗的過程中也包括重量差異，該復方制劑采用的是最低裝量檢驗法，結果見表8。

表8 裝量差異

本項結論三批藥品的裝量都大于95%，符合規定。(2020版中國藥典(四部)通則∶至 50 g 規定不少于標示的95%)

5 討論

該醫院制劑復方紫云膏采用了較為傳統的油炸法進行提取，雖然增加了藥物脂溶性成分的溶出，在臨床上取得了較好的療效。但是存在著油炸的過程溫度較高的問題，使制備過程中不穩定性因素增多，不容易控制。紫草作為主藥，有效成分會隨著油溫的增加而減少，尤其實在 140 ℃ 以上，左旋紫草的含量減少至55%。本實驗對該復方制劑的提取工藝進行優化，減少有效成分的損失。最后實驗結果顯示最佳的提取工藝為提取溫度 130 ℃，提取時間為 30 min，浸漬時間為 24 h，然后根據此工藝條件，平行制備3批，對工藝進行驗證后，表明提取工藝穩定性優良，可行性高，重復性好，符合醫院制劑復方紫云膏的質量要求，可以為其生產提供參考。

此外質量檢驗在醫院制劑中仍然是非常值得關注的問題，醫院制劑有其特殊性，是藥品生產企業無法代替的。為保證自制制劑的質量，加強檢驗是有效的手段之一[22]。