老年COPD急性加重期患者血清miR-448-5p、Six1水平及其臨床意義*

夏君燕,張 英,高永紅

北京航天總醫院干部醫療(老年醫學)科,北京 100076

慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有高患病率和死亡率。世界衛生組織預測COPD全球死亡率和殘疾率未來十年內將持續增加[1]。COPD急性加重主要癥狀為呼吸困難加劇,是導致不良結果的關鍵因素[2]。平均而言,一名COPD患者每年發生1.5次急性加重[3]。COPD的惡化會降低肺功能和生活質量,并伴隨著疾病相關負擔的提高和高住院死亡率[4-5],其在老年人群中更加嚴重。因此尋找能夠預測或評估老年COPD急性加重期的新型分子標志物十分重要。microRNA(miRNA)作為非編碼RNA,具有抑制翻譯或促進mRNA降解的功能,是強大的基因調節劑[6]。miRNA參與了許多細胞活動,在炎癥和感染性疾病等多種疾病中被用作重要的生物標志物和治療靶點[7]。YANG等[8]采用實時熒光定量PCR法測定miR-448-5p的表達,發現其在哮喘小鼠肺組織及支氣管上皮細胞中均明顯降低。Six1屬于同源盒基因家族,在正常成人組織中表達很低[9],在惡性腫瘤如肺癌[10]、肺部疾病如肺纖維化[11]中均發揮作用。研究證明Six1在哮喘患兒的支氣管肺泡中表達顯著增加[12]。以上研究表明Six1在肺部疾病的發病機制中發揮一定作用,然而關于其在COPD中的作用目前尚需進一步探討。本研究分析了miR-448-5p、Six1在老年COPD急性加重期患者血清中的表達水平及其與COPD穩定期患者及健康對照者的差異,確定二者的臨床意義,以期為COPD的治療及病情早期發現提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 2021年3月至2022年3月本院住院部收治的老年COPD急性加重期患者110例為研究對象(COPD急性加重組)。納入標準:(1)結合胸部CT、X射線、肺功能檢測及COPD急性加重期[13]和;(2)臨床資料完整;(3)依從性好可以配合治療及研究;(4)患者本人及家屬均知情同意;(5)需機械通氣>48h。排除標準:(1)惡性腫瘤者;(2)其他如社區獲得性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征等肺部疾病及免疫缺陷者;(3)肝腎功能嚴重損傷不全者。另選同期于本院就診的COPD穩定期患者60例作為COPD穩定組及健康體檢者60例作為對照組。穩定期患者納入標準:經穩定期診斷標準[14]確診為COPD穩定期,其余同急性加重患者標準;對照組納入標準:無COPD等肺功能、呼吸系統疾病,其余同前。本研究經醫院倫理委員會批準同意。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR法檢測血清中miR-448-5p表達水平 COPD患者于入院24 h內抽取空腹靜脈血5 mL(對照組體檢當日抽取),3 000 r/min置于低速離心機離心20 min,取上清液,分為兩份,于-80 ℃冰箱保存,待測。取其中一份依據Trizol試劑(上海文韌生物科技有限公司)所述操作步驟提取血清總RNA,并測定總RNA水平及純度,依逆轉錄試劑盒(上海翌圣生物科技股份有限公司)說明逆轉錄合成cDNA,采用ABI 7500型qPCR儀(美國ABI公司)檢測血清中miR-448-5p和Six1相對表達水平,miR-448-5p以U6為內參引物經設計軟件設計后由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見表1。反應條件:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,40 s;38個循環;72 ℃,5 min,各樣品重復3次以減小實驗誤差,反應結束后進行數據收集,并對Ct值進行分析,2-ΔΔCt法(Ct為循環閾值)計算目的基因miR-448-5p的相對表達量。

表1 qPCR引物序列

1.2.2酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清Six1表達 取另一份血清樣本采用ELISA法檢測血清Six1表達(嚴格遵照試劑盒說明進行所有操作),試劑盒來自上海梵態生物科技有限公司。

1.2.3臨床資料收集 收集受試者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓糖尿病史、睡眠呼吸暫停綜合征等基本資料。各組于入院當日檢測用力肺活量(FVC)、白細胞計數(WBC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1),動脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2),計算第1秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值(FEV1/FVC)、第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%pred)。所有檢測均由同一專業醫師用同一臺肺功能儀完成。

1.2.4臨床結局追蹤 COPD急性加重患者均追蹤臨床結局,統計患者發病后30 d內的死亡情況,根據臨床結局分為死亡組和存活組。23例死于院內,12例死于院外,75例存活。

2 結 果

2.1COPD急性加重組、COPD穩定組及對照組臨床資料、血清miR-448-5p、Six1水平比較 3組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓糖尿病史、睡眠呼吸暫停綜合征等方面比較差異無統計學意義(P<0.05),提示3組具有可比性;COPD急性加重組、穩定組及對照組間WBC、PaCO2、Six1依次顯著降低(P<0.05),PaO2、FEV1/FVC、FEV1%pred及miR-448-5p依次顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 各組臨床資料比較或n(%)]

2.2COPD急性加重期患者血清miR-448-5p、Six1水平與臨床指標間的相關性 相關性分析顯示,COPD急性加重期患者血清miR-448-5p水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈顯著正相關(r=0.373、0.598、0.546),與年齡、PaCO2呈顯著負相關(r=-0.354、-0.446,P<0.05);血清Six1水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈顯著負相關(r=-0.392、-0.504、-0.371),與年齡、PaCO2呈顯著正相關(r=0.425、0.463,P<0.05);血清miR-448-5p與Six1之間呈顯著負相關(P<0.05)。見表3。

表3 COPD急性加重期血清miR-448-5p、Six1水平與臨床指標間的相關性

2.3影響COPD患者急性加重的多因素Logistic回歸分析 如表4所示,以COPD患者是否發生急性加重為因變量,賦值1=是,0=否。再以表2單因素分析結果中差異有統計學意義及臨床意義的年齡、PaO2、PaCO2、FEV1/FVC、FEV1%pred、miR-448-5p及Six1(納入具體值)為自變量,進行多因素logistic回歸分析,變量之間已排除共線性的影響。結果顯示:miR-448-5p、年齡、Six1是COPD發生急性加重的影響因素(P<0.05)。

表4 影響COPD患者急性加重的多因素Logistic回歸分析

2.4死亡組和存活組血清miR-448-5p、Six1水平比較 死亡組miR-448-5p水平顯著低于存活組,Six1水平顯著高于存活組(P<0.05),見表5。

表5 死亡組和存活組血清miR-448-5p、Six1水平比較

2.5miR-448-5p、Six1表達與COPD急性加重患者30 d總生存率的關系 采用Kaplan-Meier法分析COPD急性加重患者miR-448-5p、Six1表達與患者預后的關系,結果顯示miR-448-5p高表達患者30 d生存率80.00%(44/55)高于miR-582-5p低表達患者56.36%(31/55),差異有統計學意義(Log-rankχ2=10.036,P=0.002);COPD急性加重患者Six1高表達患者30 d生存率(26/55,47.27%)低于Six1低表達患者(49/55,89.09%),差異有統計學意義(Log-rankχ2=25.954,P<0.001)。見圖1。

圖1 miR-448-5p(A)、Six1(B)表達與COPD急性加重患者30 d總生存率的關系

2.6影響COPD急性加重患者預后的多因素Cox回歸分析 以COPD急性加重患者是否死亡為因變量,賦值1=是,0=否。再以miR-448-5p及Six1(納入具體值)為自變量,進行多因素Cox回歸分析,變量之間已排除共線性的影響。結果顯示:miR-448-5p、Six1是COPD急性加重患者死亡的影響因素(P<0.05),見表6。

表6 影響COPD急性加重患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

COPD是嚴重危害成年人尤其是老年人身體健康的多種炎癥細胞介導的慢性氣道炎癥性疾病,多種炎癥細胞、促炎因子(如白細胞介素-1、6及腫瘤壞死因子-α等)等構建了極其復雜的炎癥調控網絡并參與其發生發展過程。COPD所引發的慢性炎癥臨床表現有肺通氣不足、肺微血管結構損壞、肺動脈高壓等,這些因素可能造成急性加重期患者的肺通氣/血流比失調,使其出現呼吸衰竭[15-16]。病毒和細菌感染是COPD急性加重期的最重要誘因[17]。臨床上不同分期的COPD患者會給予不同的治療方案,而目前臨床診斷COPD患者急性加重期主要依據患者基本癥狀,極易出現誤判而延誤最佳治療時機。故而尋找能夠有效評估COPD患者病情嚴重程度的生物標志物具有重要意義。

近年來越來越多的研究發現與COPD急性加重相關的miRNA,如王美華等[18]證明血清miR-146a在COPD急性加重期患者中水平升高,且與患者炎癥反應程度及肺功能和病情密切相關。李云霞等[19]通過肺功能檢測及血氣分析等手段,確定miR-155在COPD急性加重期患者血清中高表達,證明其可以導致肺損傷,對COPD產生負面效應尤其是針對COPD急性加重期患者。miR-448-5p與肺部疾病如哮喘關系密切,研究證明miR-448-5p/VEGFA軸通過調節FAS/FAS-L信號通路保護心肌細胞免于缺氧[20]。臨床資料比較發現,COPD急性加重組、穩定組及對照組間WBC、PaCO2依次顯著降低,PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred依次顯著升高,此外本研究還發現COPD急性加重組、COPD穩定組、對照組血清miR-448-5p表達水平依次升高,與前人研究結果一致,推測miR-448-5p可以通過影響肺功能來影響COPD患者病情嚴重程度,為驗證推測,進行了相關性分析,結果顯示,COPD急性加重期患者血清miR-448-5p水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈顯著正相關(r=0.233、0.598、0.546),與年齡、PaCO2呈顯著負相關(r=-0.354、-0.446);這提示低水平血清miR-448-5p可能與易導致呼吸衰竭的阻塞性氣流受限、全身炎癥反應加劇、肺泡血氣交換異常等相關,且年齡越大病情越嚴重,但具體機制仍需進一步研究。

研究表明Six1水平在哮喘血清樣品中上調,并由人支氣管上皮細胞中的TGF-β1誘導,此外,Six1缺失可能會改善TGF-β1誘導的上皮間質細胞轉化(EMT),這些數據表明Six1可能成為哮喘治療的潛在靶點[21]。本研究表明COPD急性加重組、COPD穩定組、對照組血清升Six1表達水平依次降低,相關性分析結果顯示,血清Six1水平與PaO2、FEV1/FVC及FEV1%pred呈負相關(r=-0.292、-0.504、-0.371,P<0.05),與年齡、PaCO2呈顯著正相關(r=0.425、0.463),網站預測miR-448-5p與Six1可能存在靶向關系,且研究表明miR-448-5p通過靶向Six1在哮喘中抑制TGF-β1誘導的EMT和肺纖維化[8],這與本研究中血清miR-448-5p與Six1水平呈負相關的結果一致,且死亡組miR-448-5p水平低于存活組,Six1水平高于存活組,提示二者可能通過靶向作用關系共同參與并調節COPD急性加重期患者呼吸及炎癥反應和肺功能異常等過程。且多因素Logistic回歸分析顯示miR-448-5p、Six1是COPD患者發生急性加重的影響因素,Kaplan-Meier結果顯示miR-448-5p高表達患者30 d生存率高于miR-582-5p低表達患者,Six1高表達患者30 d生存率低于Six1低表達患者,miR-448-5p、Six1是COPD急性加重患者死亡的影響因素(P<0.05),佐證了上述觀點。

綜上所述,miR-448-5p水平在老年COPD急性加重期患者血清中顯著下調、Six1在老年COPD急性加重期患者血清中顯著上調,檢測血清miR-448-5p、Six1的表達有利于對老年COPD患者病情的評估。但本研究缺乏miR-448-5p、Six1血清水平動態檢測且樣本量有限,二者參與COPD急性加重的具體機制仍需進一步研究探討,本研究主要觀察老年患者血清miR-448-5p與Six1的差異,關于非老年的研究后續將進一步跟進研究。