miR-155、PDCD4、GSN在高血壓性腦出血中的表達及預后價值研究*

裴獻光,魏海亮,高 芳,許亞寧,王志強

邯鄲市第一醫院:1.神外一科;2.外三科,河北邯鄲 056002

腦出血是由顱內微小動脈瘤破裂引起的出血,占所有腦卒中的20%左右,與高血壓關系密切,腦出血患者中有95%伴高血壓[1-2]。高血壓性腦出血(HICH)是長期高血壓導致顱腦內小動脈管壁破裂發生變性、缺血、壞死等病理改變而造成血管破裂出血的疾病,多見于中老年[3]。我國HICH發病率逐年增加,發病兇險,患者常表現為意識障礙、肢體乏力,嚴重者可出現大小便失禁、抽搐、昏迷癥狀,其病死率和病殘率均較高,部分HICH患者治療后仍存在神經功能障礙,3個月內病死率最高可達18.4%[4-5]。因此,尋找特異性指標對評估HICH的嚴重程度和預后尤為重要。微小核糖核酸(miRNA)-155(miR-155)與腫瘤、免疫、造血、炎癥有關,在腦組織缺血缺氧過程中可加重組織損傷[6]。程序性細胞死亡蛋白4(PDCD4)屬細胞死亡因子,參與細胞增殖、凋亡過程,PDCD4與腦出血有關[7]。凝溶膠蛋白(GSN)屬肌動蛋白結合蛋白,具有清除肌動蛋白、減輕機體損傷的作用[8]。miR-155、PDCD4、GSN均在HICH疾病中發揮重要作用,但作為臨床檢測指標,三者同時在HICH患者中進行檢測的報道較少,因此,本研究旨在探討miR-155、PDCD4、GSN在HICH中的表達情況及用于預測HICH患者預后的價值,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2021年1月至2022年1月本院收治的150例HICH患者納入研究作為研究組,男86例,女64例;年齡45～70歲,平均(53.68±6.75)歲;體重指數21～25 kg/m2,平均(23.65±1.31)kg/m2;高血壓病程2～8年,(平均3.68±0.54)年;84例有吸煙史,73例有飲酒史,75例合并糖尿病,67例合并冠心病。另外,選取同期于本院治療的150例無腦出血的高血壓患者作為對照組,男80例,女70例;年齡45～68歲,平均(52.87±6.71)歲;體重指數21～25,平均(23.73±1.20)kg/m2;高血壓病程2～7年,平均(3.61±0.52)年;76例有吸煙史,61例有飲酒史,65例合并糖尿病,60例合并冠心病。本研究經本院醫學倫理委員會批準。納入研究者或其直系親屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準 納入標準:(1)研究組患者符合《高血壓性腦出血》[9]中HICH的診斷標準,經影像學頭顱CT檢查顯示高密度影像,既往有高血壓史,首次發病,發病6 h內入院,有HICH所致神經功能缺損癥狀,確診為HICH;(2)對照組患者在未使用高血壓藥物情況下,收縮壓≥140 mmHg或(和)舒張壓≥90 mmHg,確診為高血壓,經頭顱CT檢查未發現高密度影像。排除標準:(1)伴凝血功能異常、腦疝、血管病變、嚴重精神疾病者;(2)外傷所致腦出血,伴有傳染性、免疫性疾病、嚴重感染者;(3)存在腦部及其他惡性腫瘤者。

1.3方法

1.3.1標本采集 取患者空腹靜脈血5 mL,以3 500 r/min離心10 min待測。

1.3.2miR-155檢測 使用聯邁生物Trizol試劑盒分離得到細胞RNA,使用凈信實業公司的核酸定量檢測儀檢測其濃度、純度,以總RNA為模板,經過逆轉錄得到cDNA,然后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測。反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環。miR-155引物序列為F:5′-CTCGTGGTAATGCTAATTGTGA-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6為內參,U6引物序列為F:5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′,R:5′-GTGCAGG GTCCGAGGT-3′。以U6作為內參基因,最后用2-ΔΔCt法計算miR-155相對表達水平。

1.3.3PDCD4檢測 采用莼試生物公司的人PDCD4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進行檢測,分別設置空白孔、標準孔、待測樣品孔,標準孔加入標準品50 μL,待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL,再加待測樣品10 μL,混勻后置37 ℃下溫育30 min,甩去孔內溶液,拍干,加滿洗滌液靜置30 s后甩去孔內溶液,拍干,反復5次,除空白孔外每孔加酶標試劑50 μL,再次溫育洗滌,加入顯色劑A、B各50 μL,37 ℃避光顯示15 min,每孔加50 μL終止液,在450 nm波長處測吸光度值。

1.3.4GSN檢測 采用侖昌碩生物公司的GSN ELISA試劑盒檢測,設置標準孔、待測樣品孔并加入200 μL標準品、待測樣品,空白孔不加,混勻后置于37 ℃ 60 min,甩去孔內溶液,拍干,用洗滌液洗板3次,每孔加入200 μL封閉液,置于37 ℃ 60 min,用洗滌液洗板3次,甩干,加入200 μL稀釋液,37 ℃放置120 min,洗滌3次,甩干,加入200 μL辣根過氧化物酶羊抗兔抗體,37 ℃放置60 min,再次洗滌3次,甩干,加入底物200 mL于暗處反應15 min,每孔加入50 μL終止液混勻,在450 nm處測吸光度值。

1.4觀察指標 (1)比較研究組、對照組患者miR-155、PDCD4、GSN水平。(2)比較HICH不同嚴重程度患者miR-155、PDCD4、GSN水平,嚴重程度以美國國立衛生院卒中量表(NIHSS)評分[10]進行評估,共有11個項目,總分為42分,輕度0～7分、中度>7～15分、重度>15～42分,分數越高,神經受損程度越嚴重。(3)比較HICH不同預后患者miR-155、PDCD4、GSN水平,預后情況采用格拉斯哥(GOS)[11]評分評估,總分數為1～5分,1分為死亡,5分為痊愈,分值越高,表明預后越好,將1～3分記為預后不良組,4～5分記為預后良好組。(4)分析miR-155、PDCD4、GSN與HICH嚴重程度、HICH預后的相關性。(5)比較HICH不同預后患者一般資料,包括性別、男性、體重指數、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、冠心病史,出血量、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C);采用邁瑞全自動生化分析儀BS-280檢測患者甘油三酯、總膽固醇、LDL-C、HDL-C。(6)采用Logistic回歸分析HICH患者預后不良的危險因素。(7)分析miR-155、PDCD4、GSN單獨及聯合檢測對HICH患者預后不良的預測價值,并繪制受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結 果

2.1miR-155、PDCD4、GSN水平比較 研究組miR-155和PDCD4水平高于對照組(P<0.05),GSN水平低于對照組(P<0.05),見表1。

表1 研究組和對照組患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較

2.2不同嚴重程度HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較 經NIHSS評分評估,150例HICH患者中,輕度53例,中度64例,重度33例;隨HICH嚴重程度加重,miR-155、PDCD4水平增高,GSN水平降低(P<0.05),見表2。

表2 不同嚴重程度HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較

2.3不同預后HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較 經GOS評分評估,150例HICH患者中,預后良好109例,預后不良41例;預后不良組miR-155和PDCD4水平高于預后良好組(P<0.05),GSN水平低于預后良好組(P<0.05),見表3。

表3 不同預后HICH組miR-155、PDCD4、GSN水平比較

2.4miR-155、PDCD4、GSN與HICH嚴重程度、HICH預后的相關性分析 miR-155、PDCD4與HICH嚴重程度呈正相關(r=0.653、0.642,P<0.05),與HICH預后呈負相關(r=-0.625、-0.575,P<0.05);GSN與HICH嚴重程度呈負相關(-0.591,P<0.05),與HICH預后呈正相關(r=0.583,P<0.05),見表4。

表4 miR-155、PDCD4、GSN與HICH嚴重程度、HICH預后的相關性分析

2.5HICH不同預后患者一般資料比較 預后不良組出血量≥60 mL占比高于預后良好組(P<0.05),見表5。

表5 HICH不同預后患者一般資料比較或n(%)]

2.6HICH患者預后不良危險因素的Logstic回歸分析 miR-155、PDCD4水平升高,GSN水平降低是HICH患者預后不良的危險因素(P<0.05),見表6。

表6 HICH患者預后不良的Logstic回歸分析

2.7miR-155、PDCD4、GSN單獨及聯合檢測對HICH患者預后不良的預測價值分析 miR-155、PDCD4、GSN聯合檢測對HICH患者預后不良進行預測的曲線下面積(AUC)為0.954,高于miR-155、PDCD4、GSN單獨檢測的0.877、0.763、0.801(P<0.05),見表7、圖1。

圖1 miR-155、PDCD4、GSN單獨及聯合檢測用于預測HICH患者預后不良的ROC曲線

表7 miR-155、PDCD4、GSN及聯合對HICH患者預后不良的預測價值分析

3 討 論

HICH是中老年常見疾病之一,患者起病較急,表現為突然頭部劇痛,頻繁嘔吐,收縮壓高達180 mmHg以上。80%的HICH發生在幕上,由于長期高血壓影響,患者血管承受的沖擊較大,導致腦動脈內膜細胞受損,使內膜出現粥樣硬化,形成細小動脈瘤,當患者血壓突然升高時,動脈瘤破裂則出現腦出血[12]。臨床治療中,一般根據腦出血患者自身情況、腦出血的部位以及出血量選擇保守治療、開顱手術或者微創手術,但患者病死率仍居高不下,部分患者經治療后仍會有殘疾[13]。因此,尋找能有效反映HICH患者病情嚴重程度和預后的指標至關重要。

miRNA在心腦血管疾病的發生、發展中起重要作用,miR-155具有多種功能基因,由可活化的B細胞、T細胞、巨噬細胞等免疫、炎癥細胞產生,與多種疾病的發生密切相關,miR-155可作為促炎癥分子加劇炎癥過程,而炎癥反應是腦出血繼發性損傷的主要機制[14]。有研究顯示,高血壓患者中,miR-155可通過調節血管中血管緊張素Ⅱ-1型受體的表達,進而參與高血壓的發生、發展[15]。本研究中HICH患者miR-155水平高于無腦出血的高血壓患者,主要是HICH患者發生腦出血后腦組織中存在炎癥反應,外周循環系統中miRNA表達可出現動態變化,miR-155在循環系統中穩定性較高,當腦組織出現缺血缺氧后,其水平可快速上升。劉亞菲等[16]的研究表明,miR-155在HICH患者中的水平明顯升高,與血腫體積呈正相關,可作為判斷HICH患者預后的重要指標。本研究中,根據NIHSS評分將HICH患者病情分為輕度、中度、重度,結果顯示,隨著患者病情嚴重度增加,miR-155水平不斷升高。預后不良患者miR-155水平明顯高于預后良好患者。miR-155水平與疾病嚴重程度呈正相關,與預后呈負相關。miR-155水平升高是HICH患者預后不良的危險因素,提示miR-155可作為預測HICH患者預后的指標。買買江·阿不力孜[17]報道,腦出血患者miR-155水平較高,腦出血死亡患者血標本中miR-155水平顯著高于存活者,同時miR-155水平可用于預測患者6個月內的生存預后,并與NIHSS評分呈正相關。此外,王帆等[18]的研究表明,miR-155水平隨NIHSS評分升高而逐漸增高,在預后不良患者中顯著上升,可用于評估患者病情嚴重程度和預后。以上研究結果與本研究結果相似。

PDCD4是凋亡過程中上調的基因,分布在各類組織器官中,在肝癌、肺癌、腦腫瘤中研究較多,且其為低表達,可促進癌細胞侵襲、擴散,又被稱為抑癌基因[19-20]。PDCD4是細胞凋亡過程中發現的特定調節基因,其水平在細胞凋亡中升高,如在小鼠腦出血的研究中,PDCD4水平較高,由于腦出血后神經元凋亡或死亡是最嚴重后果,因此認為PDCD4表達上調可能與促神經元凋亡有關[21]。梁麗英等[22]的研究表明,miR-21能夠通過靶向調控PDCD4,進而抑制心肌細胞凋亡。本研究中,研究組PDCD4水平高于對照組,并隨著患者病情增加而上升,在預后不良患者中PDCD4水平明顯高于預后良好患者,與疾病嚴重程度呈正相關,與預后呈負相關,是HICH患者預后不良的危險因素,提示PDCD4可作為預測NICH患者預后的指標。高倩等[23]研究表明,PDCD4在腦梗死患者中水平較高,并隨損傷程度增加而增加,PDCD4有助于早期診斷腦梗死。董雨等[24]研究認為,PDCD4水平對HICH預后評估具有一定價值,在HICH患者中水平顯著升高,是HICH預后不良的危險因素。

GSN是一種中等大小的蛋白質,由375個氨基酸殘基組成,其編碼基因的長度約為70 kb,能調節肌動蛋白聚合解聚,同時在細胞運動、控制細胞程序性死亡等細胞活動中發揮重要作用。張宛越等[25]的研究表明,GSN在急性腦出血患者中水平較低,并與病情嚴重程度、預后有關,可作為預后判斷指標。本研究中,研究組GSN水平低于對照組,并隨著患者病情加重而降低,在預后不良患者中GSN水平明顯低于預后良好患者,是HICH患者預后不良的保護因素,提示GSN可作為預測HICH患者預后指標。原因為HICH可導致組織損傷,細胞間隙會釋放激動蛋白,使機體微循環受阻,引起微血栓形成和內細胞損傷,造成多器官損傷,而GSN可快速與肌動蛋白結合,降低毒性,保護機體。楊學麗等[26]研究表明,GSN在急性腦出血預后不良患者中水平較低,與其他指標結合可有效評估患者病情嚴重程度和預測預后。李愛華等[27]的研究表明,GSN水平隨患者神經缺損程度加重而增高,在預后不良的患者中降低,與疾病嚴重程度呈負相關,對腦出血患者預后的預測價值較高,監測該指標有助于更好地采取干預措施。以上研究結果均與本研究結果相似。本研究結果還顯示,預后不良患者出血量≥60 mL占比較高,預后不良患者出血量較多,出血量較多對腦組織損傷較大,患者容易合并腦疝,遺留后遺癥,本研究發現,PDCD4預測HICH患者預后不良的AUC為0.763,靈敏度、特異度分別為70.7%、81.7%,而董雨等[24]研究顯示,PDCD4預測HICH患者預后不良的AUC為0.834,靈敏度、特異度分別為71.08%、68.35%,可能是因為本研究樣本量較小而導致結果不一致。本研究結果中,GSN預測HICH患者預后不良的AUC為0.801,張宛越等[25]的研究顯示,GSN預測患者預后不良的AUC為0.748,與本研究相比較低,可能與樣本量有關,而李愛華等[27]研究顯示GSN預測患者預后不良的AUC為0.877,相比本研究的0.801較高,導致其結果的原因可能是由于本研究選取患者為HICH患者,而李愛華等[27]研究選取對象為急性腦出血患者,研究對象可能存在差異而導致結果不一致。miR-155、PDCD4、GSN聯合檢測對HICH患者預后不良的預測價值優于單項指標預測。由于本研究樣本量較小,對miR-155、PDCD4、GSN在HICH預后不良發生機制中的作用未進行詳細分析,結論難免存在偏倚。

綜上所述,miR-155、PDCD4在HICH患者中呈高表達,GSN呈低表達。miR-155、PDCD4水平升高,GSN水平降低是HICH患者預后不良的危險因素,聯合檢測這3項指標對HICH患者預后有一定的預測價值。