Ang-1模擬肽協同血管內皮生長因子對心肌梗死大鼠心臟功能的影響

王軍珂 宋思奇 施春英 于忠祥

(1 青島大學醫學部,山東 青島 266071; 2 青島大學基礎醫學院; 3 青島大學附屬青島市海慈醫院(青島市中醫院)心臟中心)

缺血性心臟病是全球范圍內導致患者死亡的主要原因之一。在心肌缺血期間,局部的血液供應不足會導致心肌細胞死亡和病理性重塑,進一步發展為心力衰竭［1］。促血管生成治療是指通過形成新生血管恢復缺血心肌的血液供應［2-4］。血管內皮生長因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子之一,能夠誘導體內新生血管的生長。然而在臨床試驗中發現,中低劑量的VEGF重組蛋白給藥后由于其快速擴散不能在心肌梗死區域形成足夠的有效濃度［5-8］。而高劑量的VEGF重組蛋白雖然有效卻可能會引起患者嚴重的不良反應［9-10］。VEGF主要作用于新生血管網形成早期,而血管生成素-1(Ang-1)在后期能夠募集血管周細胞和平滑肌細胞,因此Ang-1能有效促進血管的成熟［11］。Ang-1模擬肽(AMP)為一段來源于Ang-1的特異性短肽QHREDGS,可模擬Ang-1的活性,在體內及體外均具有與Ang-1相似的促血管形成的能力,可以抑制心肌細胞和間充質干細胞的凋亡［12-14］。因此,AMP可模擬Ang-1的功能,在血管生成的過程中發揮與VEGF協同的作用。為了提高VEGF在缺血區的有效濃度,本研究使用可以與細胞外基質-膠原特異性結合的CBD-VEGF重組蛋白,以心臟細胞外基質(c-ECM)水凝膠作為生物支架,將CBD-VEGF以及AMP結合在c-ECM上,以構建CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝膠,將該水凝膠注射到大鼠心肌梗死模型梗死區域后,觀察其對大鼠心臟功能的影響,以期能夠為缺血性心臟病的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和豬心臟由青島大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學實驗室提供;8～10周齡SD雄性大鼠共12只,體質量200～260 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。AMP、Bio-AMP(修飾了Biotin的AMP)購于生工生物工程(上海)股份有限公司;噻唑藍(MTT)購于美國Sigma公司;α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體、血管性血友病因子(vWF)抗體、胞質緊密粘連蛋白1(ZO1)抗體購于英國Abcam公司。

1.2 c-ECM的制備

將豬心臟切成小塊,交替使用高滲/低滲NaCl、胰蛋白酶、Triton-X-100以及SDS溶液進行處理,去除心肌細胞,對脫細胞組織進行冷凍干燥后,獲得c-ECM,掃描電子顯微鏡下觀察顯示其結構空隙較大,可以被用于后續實驗。將c-ECM研磨成細粉后置于胃蛋白酶和HCl混合溶液中,攪拌48 h,與NaOH和PBS在4 ℃下混合,然后于37 ℃下反應30 min,得到c-ECM水凝膠。

1.3 MTT試驗檢測不同濃度的AMP和Ang-1對HUVEC活性的影響

取處于對數生長期HUVEC細胞,以5 000個/孔的密度接種于48孔板中,加入含有體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養液。培養8 h以后,分別加入連續濃度梯度(0、25、50、100 nmol/L)的Ang-1和連續濃度梯度(0、25、50、100 nmol/L)的AMP,置于細胞培養箱中培養3 d,每個濃度設置3個復孔。取出48孔板,去除培養液,每孔加入20 μL的MTT,37 ℃下培養4 h,吸出MTT,再加入150 μL二甲基亞砜,采用酶標儀測量波長490 nm處吸光度值,以吸光度值表示HUVEC活性。

1.4 Bio-AMP和c-ECM結合實驗

向96孔板中每孔加入c-ECM 水凝膠100 μL,用pH為8.0含4 mmol/L EDTA的PBS洗滌3次后,每孔再加入配好的Traut(2.5 g/L)試劑100 μL,室溫反應2 h,生成Traut-c-ECM凝膠復合物。在另一個96孔板中分別加入0、25、50、100 μmol/L濃度梯度的Bio-AMP,每孔100 μL,加入過量的Sulfo-SMCC室溫反應1 h,生成Bio-AMP-Sulfo-SMCC復合物。將上面生成的不同濃度Bio-AMP-Sulfo-SMCC復合物與Traut-c-ECM凝膠復合物混合后,室溫孵育1 h,作為實驗組;同時將0、25、50、100 μmol/L濃度梯度的BSA加入過量的Sulfo-SMCC中室溫孵育1 h,并與Traut-c-ECM凝膠復合物混合,室溫孵育1 h,為對照組。將5%的BSA溶液分別加入實驗組和對照組中,室溫封閉1 h,再分別加入S-AP,每孔100 μL,37 ℃下100 r/min反應2 h。隨后加入P-NPP室溫反應15 min,反應完畢后加100 μL的NaOH溶液0.2 mol/L終止反應。用酶標儀測定波長405 nm處的吸光度值,對照組和實驗組與c-ECM的結合力以吸光度值表示。每個濃度均設置3個復孔,結果取均值。

1.5 大鼠的分組及處理

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后,常規手術找到冠狀動脈左前降支,用6-0絲線結扎左前降支,構建心肌梗死模型。將模型構建成功的大鼠隨機分為PBS組(A組)、c-ECM/CBD-VEGF組(B組)和CBD-VEGF/c-ECM/AMP組(C組),每組4只。A組:將100 μL的PBS溶液經心外膜注射到大鼠梗死部位;B組:將10 μg CBD-VEGF直接連接在c-ECM水凝膠上,后經心外膜注射到大鼠梗死部位;C組:先將10 μg CBD-VEGF直接連接在c-ECM水凝膠上,再通過化學交聯劑與10 μg AMP交聯,然后經心外膜注射到大鼠梗死部位。最后3組大鼠均清除胸腔內積血并放置留置針,防止氣胸,將胸壁逐層縫合消毒。用留置針抽吸胸腔內的氣體和液體,之后取出留置針。術后連續3 d每只大鼠肌肉注射青霉素(160萬單位)和卡洛芬(2 mg/kg)。

1.6 超聲檢測各組大鼠的心臟功能

各組大鼠均于治療后3個月時全身麻醉,經胸超聲心動圖進行檢測。采用EchoPacTM軟件對數據進行定量分析。以左心室射血分數(EF)為評價大鼠心臟功能的指標。

1.7 免疫熒光染色

將全麻的各組大鼠脫頸處死后,從心尖處注射生理鹽水沖洗心臟后,取出心臟分離出心肌梗死的區域,切成碎塊,固定于40 g/L多聚甲醛中24 h,蔗糖脫水后OCT包埋,制備5 μm厚冰凍切片。分別用α-SMA抗體(1∶400稀釋)、vWF抗體(1∶800稀釋)、ZO1抗體(1∶200稀釋)對切片進行染色后,置于熒光顯微鏡下觀察、拍照,采用Image J軟件進行數據處理,分別計算血管數量(α-SMA抗體標記的數量)、vWF陽性面積比和ZO1陽性面積比。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 不同濃度的AMP和Ang-1對HUVEC活性的影響

在AMP和Ang-1濃度均為0 nmol/L時HUVEC的吸光度值分別為0.32±0.04、0.40±0.02,均為25 nmol/L的濃度時HUVEC的吸光度值分別為0.48±0.06、0.55±0.04,均為50 nmol/L的濃度時HUVEC的吸光度值分別為0.49±0.02和0.53±0.06,均為100 nmol/L濃度時HUVEC的吸光度值分別為0.47±0.02、0.45±0.01,各處理濃度的吸光度值比較無顯著差異(P>0.05)。

2.2 Bio-AMP與c-ECM的結合力檢測

結合實驗檢測結果顯示,對照組中不同濃度的BSA與c-ECM的結合力比較均無顯著性差異(P>0.05);在實驗組中,隨著Bio-AMP濃度升高,BSA與c-ECM結合力逐漸升高(F=19.050,P<0.05);組間比較顯示,在BSA和Bio-AMP濃度均為0.5、1.0 g/L時,對照組和實驗組的BSA與c-ECM的結合力比較差異具有顯著意義(t=5.041、5.148,P<0.05),在BSA和Bio-AMP濃度均為0、0.25 g/L時兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 BSA、Bio-AMP與c-ECM的結合力比較

2.3 各組大鼠心臟功能比較

各組大鼠均處理3個月以后,心臟超聲心動圖檢測結果顯示,A～C組的EF值分別為(67.93±3.17)%、(75.70±4.37)%和(85.47±3.20)%,3組間比較差異有顯著性(F=23.610,P<0.05),組間兩兩比較差異均有顯著性(t=2.855～7.794,P<0.05)。

2.4 各組大鼠心肌梗死區域相關指標的比較

各組大鼠處理3個月后,免疫熒光染色檢測結果顯示,3組大鼠心肌梗死區域的血管數量、vWF陽性面積比和ZO1陽性面積比進行比較差異均有顯著性(F=13.360～223.300,P<0.05),組間兩兩比較,心肌梗死區域vWF陽性面積比和ZO1陽性面積比差異均有顯著性(t=4.328～22.390,P<0.05),血管數量方面進行比較,B組、C組與A組之間具有顯著差異(t=3.500、4.950,P<0.05),B組與C組無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠心肌梗死區域相關指標比較

3 討 論

全球人群中心血管系統疾病的發病率和死亡率逐年增高,其中心肌梗死和心力衰竭是死亡的主要原因之一［15］。雖然心肌梗死患者初次經皮冠狀動脈介入治療提高了早期生存率,但其5年生存率僅為50%［3］。近年來,各種促血管生成的生長因子被廣泛應用于缺血性心臟病的治療［2,16］。然而,其療效并不是很理想,可能因為這些研究只是以單個生長因子為研究對象,而忽略了其他生長因子的相互影響,例如Ang-1、血小板衍生生長因子等生長因子聯合使用對穩定新生血管具有協同作用［17-18］。因此,多種因子聯合使用的效果可能要優于單一生長因子的使用。

本研究生成的c-ECM水凝膠經掃描電子顯微鏡觀察顯示,其結構空隙較大,可以為內皮細胞的遷移、增生以及新生血管網的形成提供足夠的空間支持,可以用于后續實驗。本研究是以c-ECM水凝膠作為基質,并結合CBD-VEGF和AMP,檢測CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝膠對心肌梗死大鼠心臟功能的影響。目前治療缺血性心臟病中常使用的生物材料有纖維蛋白［19］、透明質酸［20］、基質膠［21］、海藻酸鹽［22］、殼聚糖［23］、自組裝肽［24］、微球［25］等,這些生物材料本身也具有促進血管再生和心臟功能恢復的能力［26］。c-ECM是通過脫細胞處理去除原有的心肌細胞組分,留下心臟組織細胞外基質的三維結構和關鍵的信號分子,這對于心臟組織工程發揮著重要的作用［27］。另外,c-ECM具有可生物降解性、生物相容性和低免疫原性等優點［28］。在包括大鼠和豬的心肌梗死模型在內的多種體內模型中,注射c-ECM水凝膠后能夠促進新生血管形成,保護心肌細胞,并且恢復心臟功能［29-31］。因此,本研究使用c-ECM作為生物支架攜帶VEGF和AMP。

本研究通過MTT實驗檢測不同濃度的AMP、Ang-1對HUVEC活性的影響,其結果表明合成的AMP和Ang-1具有相似促進HUVEC增殖的能力,因此將AMP用于后續實驗,可以保證實驗效果。為了檢測設計的Bio-AMP和c-ECM的結合能力,本研究使用Traut試劑與c-ECM交聯,Sulfo-SMCC和Bio-AMP化學交聯,進而將Bio-AMP結合在c-ECM上,結果顯示Bio-AMP與c-ECM的結合力較強,可以用于后續實驗。以往研究表明,重組VEGF蛋白或VEGF基因治療心肌缺血以后,可以增強缺血心肌側支循環的血流量,并且改善心臟功能［6,32-33］。但是這種療法的安全性還有待進一步提高,因為高劑量的VEGF有導致血管瘤形成的風險,并且VEGF的擴散也可能會引起其他嚴重不良反應。ZHANG等［34］成功制備了一種由VEGF和CBD組成的融合蛋白CBD-VEGF,并且實驗證明融合蛋白CBD-VEGF能穩定地與Ⅰ型膠原結合并維持VEGF的活性。而且CBD-VEGF能夠聚集在梗死區域,保持CBD-VEGF的局部有效濃度,改善大鼠心肌梗死之后的心臟功能。另外,REIS等［35］首次證明了QHREDGS多肽(即AMP)修飾的水凝膠可以顯著改善心肌梗死后心臟功能。因此本研究把CBD-VEGF加載到c-ECM水凝膠上,并且通過化學交聯將AMP連接在c-ECM水凝膠上,將其注射在大鼠心肌梗死的部位。為了評估大鼠心肌梗死區域血管生成的情況,本研究通過vWF、α-SMA檢測了心肌梗死區域血管新生狀況,檢測的結果顯示,與CBD-VEGF/c-ECM進行比較,CBD-VEGF/c-ECM/AMP能夠顯著促進更多的血管生成,并且心臟功能明顯改善,提示VEGF和AMP在促進大鼠心肌梗死治療中具有協同作用。緊密連接或閉合帶可在上皮細胞和內皮細胞之間形成一個連續的屏障,能夠阻斷頂端和基底外側細胞表面之間跨膜蛋白的運動［36］。ZO1是一種接頭蛋白,可將閉合蛋白和密封蛋白等跨膜連接蛋白結合到肌動蛋白細胞骨架上面［37］。因此ZO1對緊密連接的形成發揮不可或缺的作用。為了檢測大鼠心肌梗死區域細胞之間的連接情況,本研究通過ZO1抗體對ZO1也進行了檢測,其結果顯示,心肌梗死模型大鼠經CBD-VEGF/c-ECM/AMP治療以后,ZO1陽性面積比顯著高于經CBD-VEGF/c-ECM治療大鼠,提示相較于CBD-VEGF/c-ECM,CBD-VEGF/c-ECM/AMP能夠形成更多的細胞連接。

綜上所述,本研究合成了CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝膠,該水凝膠通過心外膜注射到心肌梗死區域后可以顯著促進心肌梗死區域血管再生,增強細胞之間的連接,并可促進心肌梗死后心臟功能的恢復,可能為臨床上缺血性心臟病患者的治療提供新的可能。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的動物實驗均已通過青島大學醫學部倫理委員會的審核批準(文件號QDU-AEC-2023-365)。所有實驗過程均遵照動物使用和護理指南的條例進行。

作者聲明：王軍珂、宋思奇、施春英、于忠祥參與了研究設計;王軍珂、施春英、于忠祥參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文,且均聲明不存在利益沖突。