稻田除草劑應用現狀與抗除草劑水稻育種研究進展

胡江博 任正鵬， 丁翔， 王朝全 馮陽， 王笑見 張翔 胥南飛，*

（1 四川天豫興禾生物科技有限公司，成都610031；2 合肥豐樂種業股份有限公司，合肥231283；第一作者：jbhu@gevoto；*通訊作者:nfxu@gevoto.com）

水稻是我國三大主糧之一，年平均種植面積約3 000 萬hm2，總產量約21 000 萬t，水稻穩產對我國糧食供應和社會穩定發揮著至關重要的作用[1]。由于雜草與水稻共生時間長，嚴重影響水稻生長，我國每年因雜草危害直接導致的稻谷損失約占15%～20%，雜草防控已成為水稻種植中的主要勞作之一。近年來，隨著輕簡化栽培技術快速發展，迫切需要更加有效的雜草防控措施[2]。除草劑是目前最有效、最經濟的除草手段，能有效防控雜草和提高水稻產量。在我國水稻生產中，需在多個時期噴施除草劑，共需10 余種除草劑疊加使用，藥劑種類多、除草成本高，且不同除草劑對施用條件都有嚴格限制，已無法滿足水稻輕簡高效綠色種植的需求。

現階段，能有效解決稻田雜草的辦法主要有2 種：持續開發具有新作用機制的除草劑輪換使用和創制抗除草劑水稻新品種。但隨著開發新型除草劑越來越困難，培育具有自主知識產權的抗除草劑水稻新種質，從而擴大其配套除草劑的應用范圍就顯得尤為重要。隨著我國水稻耕作方式的改變，迫切需要深入挖掘水稻自身除草劑抗性新基因、探尋除草劑生物育種新途徑、培育抗除草劑水稻新種質[3]。

1 稻田常見雜草及其發生規律

據統計，我國稻田雜草有200 多種，比較常見、危害較重的約40 種。我國水稻種植過程中，除草劑開支的80%以上用于防除稗草和千金子[4]。其中，稗草是水稻田排名第一的惡性雜草，危害面積約占播種面積的40%。另外，雜草稻是直播稻田除稗草、千金子外第三大抗性雜草，具有生長速度快、繁殖能力強、常規除草技術難以防除等特點，導致其快速泛濫[5]。近年來，雜草問題已成為抑制水稻正常生長、影響農戶種植積極性的重要因素[6]。

稻田雜草的萌發高峰期大致分為3 個階段，播種或移栽后7～10 d 出現第1 個出草高峰，約占雜草發生總量的45%～70%[7]；播種或移栽后20 d 為第2 次萌發高峰，以莎草科和闊葉雜草為主；第3 次出草峰值出現在播種或移栽后20～30 d，一般以闊葉雜草為主。

2 不同水稻種植模式雜草控制措施

隨著農村勞動力年齡結構發生變化，現在種田的多為中老年人，已難以承受育秧、移栽等繁重的田間勞作；同時，隨著人力成本不斷上升，迫使種植戶越來越多選擇直播稻等輕簡化種植模式。但雜草問題極大限制了直播技術的大規模推廣和應用，迫切需要更有效的雜草防控措施。不同水稻種植模式下的雜草發生規律和相應除草策略不同[8]。

2.1 直播稻田雜草控制措施

直播是水稻生產實現規模化、機械化、集約化的重要技術。但直播田雜草先于水稻萌發，二者共生時間長，除草難度大，極大限制了直播稻發展[9]。直播田一般使用“一封、二殺、三補”的雜草防控策略，“一封”是在播后、苗前選用2～3 種除草譜廣的除草劑進行土壤封閉殺草；“二殺”是在水稻3 葉期，選用多種苗后選擇性除草劑進行除草；“三補”是在播后30 d 對抗性雜草進行針對性補防[10]。

2.2 移栽田雜草控制措施

移栽田秧苗較大，稻根入土較深，抗藥性較強；同時，氣溫適宜、雜草發生種類多。移栽田多采用“狠抓前期，挑治中、后期”的除草策略，移栽前先用2～3 種除草劑進行封閉，施藥后2～5 d 插秧；移栽后5～10 d，用多種除草劑對大部分雜草進行防除，用藥后需保水1 周；在分蘗期按實際情況用選擇性除草劑補防1～2 次[11]。

3 稻田常用除草劑及應用現狀

3.1 選擇性除草劑應用現狀及待解決問題

本節選擇了在水稻種植中使用量大且除草效果較好的幾種選擇性除草劑[12]和常用的滅生性除草劑，分析、比較了不同除草劑在水稻田中的除草優勢和不足（表1）。

表1 水稻田常用除草劑優缺點分析

由于除草劑長期不合理使用，近年來雜草群落演替加快、抗性雜草蔓延迅速、雜草數量呈直線上升趨勢。2021年全國農業有害生物抗藥性監測報告顯示，稗草和千金子對氰氟草酯的抗性頻率分別超過65.4%和78.3%；稗草對五氟磺草胺抗性頻率已超過76.8%，且五氟磺草胺對千金子無效[13]；在我國某些地區稗草對丁草胺的抗性已超過70.0%[14]；稗草對二氯喹啉酸抗性頻率已超過91.5%[15]。

截止2019年，全球已有255 種雜草的496 個雜草生物型對除草劑產生抗性，其中對ALS 抑制劑產生抗性的達到160 個雜草生物型，約占總數的1/3[16]，詳細數據可參考圖1[17]。另外，光系統Ⅱ抑制劑和ACCase 類抑制劑由于抗性位點單一，抗性雜草的發展速度非常迅猛（C2、C2、C5 和A 組）。草甘膦抗性雜草近幾年在全球發展較快（G 組），但由于過去20 多年草甘膦在轉基因抗草甘膦作物上使用量巨大，同時考慮到抗性衰減及可能存在的抗性漂移等因素，整體而言其抗性雜草發展相對較慢，抗性發展趨勢處于穩定范圍。草銨膦和三酮類除草劑（F2 組）抗性雜草的發展速度相對緩慢，抗性風險較低[17]。

圖1 不同作用機理除草劑抗性雜草的發展趨勢圖[17]

另外，除草劑的殘留問題一直未得到人們足夠的重視，除草劑使用不當容易在土壤和水體中殘留，不僅影響當季作物，還會嚴重影響后茬作物。馮莉等[18]研究了5 種稻田常用除草劑對后茬馬鈴薯的影響，發現噁唑酰草胺、雙草醚、五氟磺草胺、芐嘧磺隆、二氯喹啉酸對馬鈴薯的抑制程度依次由低到高，雙草醚在推薦劑量可對馬鈴薯產生藥害，二氯喹啉酸在推薦劑量的1/15～1/20 即對馬鈴薯地上生長抑制率達50%。王子臣[19]等試驗了3 種稻田常用除草劑在水體殘留對大藻生長的影響，其中芐嘧磺隆可導致大藻大量死亡，2 甲4 氯鈉和丁草胺亦均會對大藻生長產生一定抑制作用。王新等[20]研究了咪唑啉酮類除草劑殘留對后茬作物影響，發現咪唑乙煙酸雖然使用當年可降解96%，但剩余部分會在土壤中長期殘留，對后茬作物造成藥害，其低劑量即可抑制后茬油菜株高，較高劑量殘留會導致油菜全部死亡。

其次，在環境中殘留期長的除草劑對動物、生活用水等有多大影響？雖然目前很少有這方面的研究報道，但這是我們不應該忽視的問題。

3.2 廣譜型除草劑應用范圍及除草優勢

草銨膦和草甘膦屬于廣譜型除草劑，與咪唑啉酮類除草劑相比，具有殘留期短、不易產生抗藥性、對環境友好、價格低廉等優點。有數據顯示，草甘膦、草銨膦和硝磺草酮在全球除草劑銷量排行榜位居前三[21]。由此可見，除草劑正朝著高效、低毒、無殘留、殺草譜廣和環境友好型的方向發展。

3.2.1 草甘膦

內吸型滅生性除草劑，通過抑制植物體烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶EPSPS，影響莽草酸向芳香族氨基酸的轉化，導致其蛋白質合成受阻。草甘膦可防除40 余科、130 多種植物，在植物體內和分蘗間皆可傳導，并由地上組織傳導至根部。草甘膦使用后7 d 見效，無殘留，不影響后茬作物和土壤結構，對地下水無污染，對環境友好，用藥后7～10 d 即可播種、移栽[22]。獨特的除草機制、優異的除草效果、安全性高及能在轉基因抗草甘膦作物上使用，促使其成為全球用量最大的除草劑[23]。

3.2.2 草銨膦

觸殺型滅生性除草劑，通過抑制植物氮代謝途徑中谷氨酰胺合成酶GS，干擾植物正常代謝致死。草銨膦能快速殺死絕大多數雜草。草銨膦噴施后3 d 即可殺死雜草，使用4 d 后即可播種移栽，對土壤、作物根系和后茬無影響，持效期較長，在土壤中易降解，對作物安全，不易飄移。生產中應用草銨膦具有除草活性高、廣譜、低毒、對環境友好等優點。

3.2.3 三酮類除草劑

通過抑制對羥基苯丙酮酸雙加氧酶HPPD，影響類胡蘿卜素合成，促使雜草的分生組織和新生器官出現白化癥狀而死；能高效防除闊葉雜草及部分禾本科雜草，具有良好的觸殺和內吸作用。三酮類除草劑藥后3～7 d 見效，持效期較長，但不會影響后茬作物，藥后3 h 遇雨藥效不受影響。該類除草劑目前僅有4 例抗性雜草報道，非常適合抗性雜草的綜合治理[24]。

草甘膦和草銨膦不僅能防除絕大多數雜草，還能殺死與水稻親緣關系相近的雜草稻。三酮類除草劑能很好地彌補草甘膦、草銨膦的局限和不足，形成完善的雜草防控體系。但由于常規水稻均不含這三類除草劑的抗性基因，直接施用會對水稻產生同樣的毒害作用，該類除草劑目前還不能直接在水稻田大規模使用。因此，急需研發具有自主知識產權的抗草甘膦、草銨膦和三酮類除草劑的水稻新種質。

4 抗除草劑水稻育種研究進展

近年來，不少研究團隊利用自然變異、化學誘變、轉基因、基因編輯和自優育種等技術，針對不同類型除草劑標靶基因進行深入研究，創制了一系列抗除草劑水稻新種質。

4.1 內源基因改良抗除草劑水稻

4.1.1 通過大規模水稻品種篩選發掘自然變異抗性材料

2018年，王芳權等[25]通過大規模咪唑乙煙酸抗性篩選，從7 000 多份水稻材料中篩選出1 個抗該除草劑的水稻材料Jinjing818。2020年，畢俊國等[26]通過除草劑抗性篩選，從30 570 份水稻資源中挖掘出1 份抗咪唑啉酮類除草劑的水稻新種質。

4.1.2 通過化學誘變創制具有不同除草劑抗性的水稻突變體

2012年，陳竹鋒等[27]利用EMS 誘變秈稻品種黃華占，篩選獲得一批抗咪唑啉酮類突變體。2018年，張保龍團隊[28]利用EMS 誘變粳稻品種Zhennuo19，獲得1 個抗ACCase 類除草劑的突變體材料。該團隊還利用EMS 誘變Zhendao18 等粳稻品種，篩選出多個抗咪唑啉酮的水稻新種質[29]。

4.1.3 通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術對水稻內源基因進行定點編輯

2016年，LI 等[30]利用基因編輯技術對水稻內源基因OsEPSPS 的TIPS 位點進行定點替換，獲得了抗草甘膦的水稻新種質。2015年，SUN 等[31]利用該技術在粳稻品種日本晴中定點突變OsALS 基因，獲得的株系對雙草醚具有良好抗性。2020年，WANG 等[32]同樣利用該技術在南粳9108 中定點突變OsALS 基因，獲得抗咪唑啉酮類除草劑的水稻新種質。

4.1.4 通過自身基因優化育種培育抗除草劑水稻

2016年，為解決抗除草劑“基因挖掘難”和“突變不定向”等技術難題，四川天豫興禾生物科技有限公司從作物基因組中尋找除草劑靶標基因進行深入研究，獨創多個抗除草劑基因定向進化方法[33-34]，利用該技術對靶標基因具有突變速度快、精準度好、篩選效率高的特點，成功創制出一批抗草甘膦和抗草銨膦的植物內源突變基因[35-38]，形象稱之為“基因超進化”系統。

同時，為了不引入外源基因及轉基因成分，根據上述突變基因的專利信息，利用PCR 技術重新對水稻OsEPSPS 野生型基因進行精準突變，突變后的OsEPSPS 基因片段，不含任何非必要突變和外源序列，未進行基因重組。將突變后的OsEPSPS 基因片段通過基因槍精準雜交到水稻品種中，獲得無載體系統不含外源基因片段的抗草甘膦水稻新種質，該試驗過程稱為“自身基因優化育種”（簡稱自優育種）。由“基因超進化”創制的突變基因對草甘膦的耐受性超過田間推薦劑量20 倍，同時對其他農藝性狀無不良影響，具有很大的商業化推廣價值[39]。

4.2 導入外源基因獲得抗除草劑水稻新品種

2014年，王云鵬等[40]通過其建立的草甘膦污染土壤宏基因組文庫克隆出1 個高抗草甘膦的soil EPSPS基因，將該基因轉入粳稻品種Jinongda878，獲得轉基因抗草甘膦的水稻新種質。2015年，梅鋒[41]將抗蟲基因HJC-1 和抗草甘膦基因G6-EPSPS 同時導入秀水110，獲得轉基因抗蟲耐草甘膦水稻新種質G6H1。2017年，DONG 等[42]將來自熒光假單胞菌的G2-EPSPS 轉入中花11，獲得轉基因的抗除草劑水稻新種質。

2013年，翁綠水等[43]將抗蟲基因Cry2Aa# 和抗草銨膦基因Bar 同時轉入水稻恢復系D68，培育出抗蟲、耐草銨膦轉基因恢復系B2A68。2016年，徐海英等[44-45]將來自不同細菌的基因Pa-HPPD、Pp-HPPD 和Ct2-HPPD 同時導入水稻材料，獲得多個抗異噁唑草酮水稻新種質。2005年，KAWAHIGASHI 等[46]將3 個細胞色素P450 家族基因CYP1A1、CYP2B6 和CYP2C19 分別導入日本晴，獲得抗不同類型除草劑的轉基因株系。2012年，沈志成團隊[47]從狗牙根中克隆了1 個細胞色素P450 基因N-Z1，并將其導入秀水134，獲得分別抗煙嘧磺隆和硝磺草酮的轉基因植株。

4.3 內源基因改良抗除草劑水稻應用潛力

草甘膦作為全球應用最廣泛的除草劑，其巨大的市場價值使得抗草甘膦基因挖掘成為各國農業生物技術公司競爭和布局的焦點。岳榮生等[48]披露了全球抗草甘膦基因專利的申請情況。截至2020年10 月，我國抗草甘膦基因專利總量排名全球第二，其中中國農業科學院、四川天豫興禾生物科技有限公司和先正達集團分列全球第七、八、十位，具體專利數據詳見表2。目前，國內外其他申請人在抗草甘膦基因核心專利中披露的基因均來自微生物，而四川天豫興禾生物科技有限公司通過專利技術，獲得了一大批具有自主知識產權的植物內源抗草甘膦突變基因，未來具有較大的發展潛力和市場競爭優勢。

表2 抗草甘膦基因專利重點申請機構情況[49]

四川天豫興禾生物科技有限公司研發的“基因超進化”系統，能快速創制植物內源抗除草劑基因，解決了滅生性除草劑作物內源抗性基因缺失的難題[49]。該作物內源突變基因通過自優育種技術培育出多個抗草甘膦水稻新種質。同時，還能利用基因編輯系統對這些植物內源突變基因進行定點編輯，創制基因編輯抗除草劑作物，或利用轉基因技術開發相應的轉基因產品。自優育種抗草甘膦水稻的成功創制，能顯著拓寬滅生性除草劑在稻田中的使用范圍，不僅能降低水稻除草成本，還可顯著降低除草劑用量。經測算，每667 m2田至少能節本增收100～200 元（減少除草成本、人工成本、田間管理成本，以及提高品質增效等）。

5 討論與展望

農田雜草嚴重影響水稻產量，間接影響稻米品質，增加農民生產成本投入，影響水稻生產安全。

目前，水稻田常用除草方案均需多次施用不同類型的選擇性除草劑，雖然緩解了部分雜草的危害，但對抗性雜草的防效越來越差。種植戶為保證除草效果，經常加大用藥劑量或重復噴藥，這樣不僅容易對水稻和后茬作物造成藥害，雜草的抗性也呈現普遍性發生和區域性暴發；同時，除草劑濫用也導致其殘留增加，引發農產品的食品安全和生態環境污染問題。

由于傳統育種手段選育周期長、工作量大等問題，難以滿足日益豐富的育種目標[50]。特別是水稻中對除草劑抗性基因的自然選擇難度較大，鮮有通過自然選擇獲得高抗除草劑水稻新品種的報道。

在抗除草劑水稻創制中，研究人員主要針對廣譜型除草劑的標靶基因進行研究。目前，應用比較成功的主要包括抗草甘膦、草銨膦和咪唑啉酮類除草劑水稻。巴斯夫公司、深圳潔田模式生物科技有限公司和江蘇省農業科學院分別通過EMS 誘變，獲得了抗咪唑啉酮類除草劑水稻Clearfield、jietian1hao 和金粳818 等。金粳系列抗咪唑煙酸水稻在江蘇推廣面積已達到6.7 萬hm2以上，潔田系列水稻在安徽、江蘇、廣東都有小規模示范種植。由此可見，我國對于抗除草劑水稻的市場需求非常大。

抗咪唑啉酮類水稻無法規和政策限制，更易被大眾接受。但該類除草劑殘留期長，會對后茬敏感作物造成藥害。同時，隨著咪唑啉酮類除草劑大量使用，近年來抗性雜草數量激增，影響了咪唑啉酮類除草劑進一步推廣[51]。抗草甘膦水稻和抗草銨膦水稻使用轉基因技術將細菌中發現的抗性基因導入水稻中，抗草甘膦水稻雖獲得了安全證書，但由于其“轉基因身份”并未實際推廣。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術因操作方便、高效、高特異性和低成本等優點，目前已成功創制多個抗除草劑水稻新種質[52]。但要更好利用該編輯系統，還需要通過各種技術手段，挖掘更多優良的植物內源基因供該系統進行編輯。

抗除草劑水稻中HPPD 抑制劑類抗性基因研究還比較少。因此，需要加強抗三酮類除草劑水稻的種質創新。該類除草劑還未在我國水稻田大規模使用，與其他類型除草劑無復合抗性，三酮類除草劑與草甘膦、草銨膦配合使用，能安全、環保、完善解決抗性雜草問題。將這3 類除草劑與其對應的3 種抗性水稻配套使用，可為稻田雜草防控提供完善的解決方案，每季種植不同類型的除草劑抗性水稻并搭配對應的除草劑，在防控稻田雜草和抗性雜草的同時，完善解決農藥殘留、食品安全和生態環境等諸多問題，有效促進水稻直播技術的快速發展，在提高水稻生產經濟、社會、生態效益方面具有重要意義。