不同光照條件對卷枝毛霉生長發育及類胡蘿卜素合成的影響

池 銘，孫麗娟，郝浩然，馬立杰，趙 婧，李鵬霞，4，張映曈*

（1.江蘇省農業科學院 農業設施與裝備研究所，江蘇 南京 210014；2.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110866；3.江蘇省農業科學院 農業農村部農產品冷鏈物流技術重點實驗室，江蘇 南京 210014；4.江蘇省高校園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014）

類胡蘿卜素屬于類異戊二烯物質，是重要的天然抗氧化劑，具有延緩衰老、調劑免疫力和預防癌癥等多種生理功能［1］。植物與化學合成是類胡蘿卜素的傳統來源，其生產效率高，受氣候、光照和地理位置的影響較小，因此，食品微生物發酵生產類胡蘿卜素正逐漸受到人們的關注。據報道，藻類、酵母、霉菌、細菌等多種微生物均具備合成類胡蘿卜素的能力［2］。其中霉菌具有易培養、生長快、發酵條件易控制、生產成本低等優點，是微生物發酵產類胡蘿卜素的理想菌株。卷枝毛霉(Mucor circinelloides)屬于接合類霉菌，具有較強的類胡蘿卜素合成能力，且生長速率快，擁有清晰的遺傳背景和完善的分子操作體系，常被用作真菌類胡蘿卜素合成的模式菌株［3］。

光照作為一種重要的環境信號，對微生物的生長晝夜節律、形態發育和生理代謝過程均起到調控作用［4］。但在不同微生物中，光照的調控作用和方式存在一定的差異。例如粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的光應答由藍光觸發，構巢曲菌(Aspergillus nidulans)在生長過程中則響應紅光［5］，而白光、紅光和藍光均對灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)菌絲體的生長有促進作用［6］。在調控類胡蘿卜素合成方面，藍光、紅光以及白光能分別誘導三孢布拉霉(Blakeslea trispora)［7］、杜氏鹽藻(Dunaliella salina)［8］和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)［9］的類胡蘿卜素合成。采用脈沖方式［7］、提高光強度［8］以及延長光照時間［9］可以進一步提高微生物的類胡蘿卜素產量。因此，光質、光照強度和光照時間會在不同程度上影響微生物的生長發育和類胡蘿卜素合成。

迄今，有關不同光照條件對模式菌株卷枝毛霉生長發育以及類胡蘿卜素代謝影響的研究還較少。鑒于此，筆者以卷枝毛霉菌株CBS277.49為研究對象，考察了不同光質、光強和光照時間對其生長及類胡蘿卜素合成的影響，明確了光照誘導CBS277.49產類胡蘿卜素的最適條件，以期為微生物發酵法生產類胡蘿卜素的應用奠定基礎，并豐富真菌類胡蘿卜素合成光誘導機制的基礎理論知識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸硫胺（生物試劑）為國藥集團化學試劑有限公司產品；巰基乙醇（分析純）為上海麥克林生化科技有限公司產品；石油醚（分析純）為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品； RNAprep pure Plant Kit提取試劑盒由天根生化科技（北京）有限公司生產；HiScriptIII RT SuperMix for qPCR cDNA合成試劑盒由南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產。

1.2 儀器與設備

LED燈帶為歐曼有限公司產品；紫外可見分光光度計（UV-1102）為上海天美科學儀器有限公司產品；PCR儀（EDC-810）為東勝國際貿易有限公司產品；CFX connect熒光定量聚合酶鏈式反應儀由美國Bio-Rad公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制 YPG培養基：10.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L瓊脂粉、3.0 g/L酵母提取物、12.5 g/L無水葡萄糖。YNB培養基：1.5 g/L硫酸銨、1.5 g/L谷氨酸、0.5 g/L酵母氮源、10.0 g/L無水葡萄糖、20.0 g/L瓊脂粉。高壓滅菌后添加硫胺素和煙酸，終濃度為1.0 μg/mL。

1.3.2 菌體的培養 使用YPG培養基活化卷枝毛霉CBS277.49菌株，并在光照條件下產孢。使用無菌水沖洗平板，得到孢子液，并用血球計數板計數，調整孢子濃度為×107個/mL。

接種孢子液至YNB培養基，在（26±2）℃下培養84 h。前60 h置于黑暗條件進行培養，后24 h采用不同光質（紅、綠、藍和黑光）、不同光強（250、500、750和1000 lx）和不同光照時間（6、12、18和24 h）進行培養。定期取樣，將收獲的菌絲用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 類胡蘿卜素產量的測定 采用紫外分光光度計法［10］測定類胡蘿卜素產量(μg/g)，其計算公式為：

上式中：A453為溶液在453 nm處的吸光值；D為稀釋倍數；V為提取所用石油醚體積；0.2592為消光系數；M為樣品質量。

1.3.4 基因表達的測定 RNA提取按照RNAprep pure Plant Kit說明書指導完成。cDNA合成使用HiScript III RT SuperMix for qPCR cDNA合成試劑盒。以cDNA為模板進行RT-qPCR擴增，并采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。每個處理重復3次。引物序列如下：actinF，TTGAACCCCAAGTCCAACCG；actinR，TGACACCATCACCGGAATCG。carRPF，GGGTCGA TGTCGTCGCTATT；carRPR，TTGAACAGGTGGAG GATCGC。carBF，AAGCAAGCTCACCTCTGACC；carBR，CAGCATCAGGCTCCTCCAAA。mcwc1-cF，CAACGACGACGCTTACAACC；mcwc1-cR，GGCCC AATTGGATCTGTGGA。

1.4 數據統計

對所有指標進行3次平行測定，最終結果采用平均值±標準誤差表示。使用SPSS 22.0單因素方差分析（one-way ANOVA）進行差異顯著性分析，并用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同光質對卷枝毛霉CBS277.49的影響

2.1.1 對卷枝毛霉CBS277.49菌落形態和菌絲生長的影響 由圖1A可知，黑暗條件下菌落的顏色隨培養時間的延長而無明顯變化；培養24 h時藍光處理的菌落顏色呈橙黃色，紅光處理呈明黃色，綠光處理呈微黃色。表明藍光照射能夠顯著促進卷枝毛霉CBS277.49菌落顏色的積累。

圖1 不同光質對卷枝毛霉CBS277.49的菌落顏色（A）、生物量（B）和菌絲生長狀態（C）的影響

由圖1B可知，在培養期間所有處理的菌落生物量均呈逐步上升趨勢，在培養12 h后積累速度有所減緩；不同光質處理對菌落的生物量均有顯著影響，在培養6～24 h期間3個光質處理的菌落生物量均顯著高于黑暗條件下的，但3個光質處理之間差異不顯著。

真菌通常與植物一樣具有向光性。使用不同光質單束光源側方向照射24 h，結果如圖1C所示，在綠光和藍光照射下，菌絲均朝著光照的方向生長；而在紅光照射下，菌絲的生長方向毫無規律，與黑暗條件下相仿。

2.1.2 對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產量的影響 如圖2A所示，光質處理對類胡蘿卜素產量有促進效果，3個光質處理在培養6 h時的類胡蘿卜素產量相當。在培養6～12 h期間，藍光處理的類胡蘿卜素產量急劇上升，并在12 h時達到峰值，為黑暗對照的22.08倍；紅光與綠光處理的類胡蘿卜素產量呈現小幅度上升趨勢，而黑暗對照的類胡蘿卜素產量無明顯變化。至24 h時，3個光質處理的類胡蘿卜素產量均顯著下降，但藍光處理的類胡蘿卜素產量仍顯著高于其他2個處理和黑暗對照的，說明藍光照射可以顯著提升CBS277.49的類胡蘿卜素產量。

圖2 不同光質對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產量和合成基因表達的影響

2.1.3 對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成基因表達的影響 卷枝毛霉中編碼八氫番茄紅素脫氫酶的carB基因以及編碼八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環化酶的carRP基因負責將植物烯轉化為β-胡蘿卜素，是類胡蘿卜素合成過程中的2個關鍵基因［11-12］。如圖2B、圖2C所示，不同光質處理對carB和carRP的表達量有不同影響。在藍光處理下carB的表達量隨著培養時間的延長而呈先上升后下降的變化趨勢，在6 h時達到最高值，是對照的96.73倍，12 h時其表達量開始下降，至24 h時與黑暗對照相比無顯著差異。紅光和綠光處理的carB表達量在整個培養期間一直顯著低于藍光處理的。在藍光處理下，carRP表達量的變化趨勢與carB的相同，在6 h時到達峰值，且在整個培養時間內始終顯著高于其他處理的。

2.2 不同光照強度對卷枝毛霉CBS277.49的影響

2.2.1 對卷枝毛霉CBS277.49菌落形態的影響 由圖3A可知，不同強度的藍光照射處理會影響CBS277.49的菌落顏色，其中在250 lx強度下培養24 h時菌落的顏色顯著提升，呈現淡黃色；在500、750和1000 lx處理下培養24 h菌落的顏色均呈現橙黃色，但在1000 lx處理下菌落外圈出現了白色年輪狀菌絲，說明菌絲積累胡蘿卜素的能力變差。

圖3 不同光強對卷枝毛霉CBS277.49的菌落顏色和類胡蘿卜素產量的影響

2.2.2 對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產量的影響 從圖3B可以看出，不同強度的藍光處理對類胡蘿卜素產量有不同影響；在培養0～6 h期間各處理的類胡蘿卜素產量均呈上升趨勢，且在6 h時存在顯著差異，光強越強，類胡蘿卜素產量越高；在12 h時500、750和1000 lx處理的類胡蘿卜素產量均達到峰值，分別為250 lx處理的2.90、2.94和3.25倍；在培養12～24 h期間500、750和1000 lx處理的類胡蘿卜素產量均呈下降趨勢，而250 lx處理則持續上升；在24 h時，藍光1000 lx處理的類胡蘿卜素產量為（1766.59±68.59）μg/g，顯著高于其他3個處理的。

2.2.3 對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成相關基因表達的影響 如圖4A和圖4B所示，不同強度的藍光處理對3個基因的表達量有不同影響。250 lx處理的carB表達量在整個培養期間變化平緩。其他3個光強處理的carB表達量隨著培養時間的增加而呈先上升后下降的變化趨勢，其中500 lx處理的carB表達量在培養12～24 h期間顯著高于250 lx處理的，但顯著低于750與1000 lx處理的（P＜0.05）。750 lx處理的carB表達量在前期顯著低于1000 lx處理的，但在24 h時顯著高于其他處理的。carRP表達量的變化趨勢與carB相似（圖4B），其中1000 lx處理的carRP表達量在6和12 h時顯著高于其他處理的（P＜0.05），但在24 h時750 lx處理的carRP表達量為所有處理中最大值。

圖4 不同光強對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成基因表達的影響

mcwc1-c基因通過編碼MCWC-1C蛋白進行藍光的感知，正向調控類胡蘿卜素合成基因carB和carRP的表達［13］。由圖4C可知：在整個培養期間250 lx處理的mcwc1-c表達量較低；500和750 lx處理的mcwc1-c表達量持續上升；1000 lx處理的mcwc1-c表達量在6 h時達到最高值后逐漸下降，在培養結束(24 h)時，分別僅為500和750 lx處理的0.61和0.39倍。

2.3 不同光照時間對卷枝毛霉CBS277.49的影響

2.3.1 對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產量的影響 由圖5A可知：光照6 h處理的類胡蘿卜素產量較低，在6 h時達到高峰，之后開始下降且顯著低于其他3個處理的；其余3個光照時間處理的類胡蘿卜素產量也呈現先上升后下降的變化趨勢，均在12 h時達到最高值，且相互間無顯著差異；培養至24 h時，18和24 h處理的類胡蘿卜素產量居前2位，且顯著高于其他2個處理的。

圖5 不同光照時間對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素產量和基因表達的影響

2.3.2 對卷枝毛霉CBS277.49類胡蘿卜素合成相關基因表達的影響 如圖5B～圖BD所示，所有處理的3個基因的表達量呈先上升后下降的變化趨勢；光照6 h處理的carB、carRP和mcwc1-c表達量的峰值均出現在6 h時，其余處理的峰值則均出現在12 h時；培養12 h后所有處理的carB、carRP和mcwc1-c表達量開始下降；在培養至24 h時，光照12 h處理的carB、carRP和mcwc1-c表達量最高，且顯著高于其他3個處理的。

3 小結與討論

本研究結果表明，光照可以顯著促進卷枝毛霉CBS277.49的菌體生長，且該菌株具有藍/綠光趨光性，在其他真菌中也有類似發現［14］。此外，藍光處理加深了CBS277.49的菌體顏色，暗示其促進了類胡蘿卜素的積累。測定發現藍光照射12 h后的類胡蘿卜素產量分別是綠光、紅光處理和黑暗對照的2.90、2.19和22.08倍；藍光處理的carB和carRP表達量在6和12 h時均顯著高于其他處理的，說明藍光通過上調結構基因的表達促進了類胡蘿卜素的合成。這與Jing等［15］在培養基中添加醋酸鹽促進carB的表達，從而提升三孢布拉霉類胡蘿卜素產量的結果相似。

以藍光為前提篩選最適光強。首先通過觀察表型發現，250 lx藍光處理的菌落顏色較淡，其余處理的菌落均為橙黃色。進一步測定類胡蘿卜素產量發現，1000 lx處理的產量最高，750和500 lx處理的產量次之，說明提高光強可以促進類胡蘿卜素的積累，這可能是因為類胡蘿卜素產量增加可以應對強光照造成的細胞氧化損傷［16］。結構基因表達量的測定結果顯示在培養前期1000 lx處理的基因表達量顯著高于其他3個處理的，說明1000 lx處理通過提高carB和carRP基因的表達量促進了類胡蘿卜素的合成。但隨著培養時間的延長，carB和carRP的表達量均呈下降趨勢，這與高光照處理三孢布拉霉后類胡蘿卜素合成基因出現短暫高表達的結果［17］相似，推測與生物為保持內環境穩態而形成的一種內在“光適應”機制有關［18］。進一步研究發現在1000 lx藍光處理下調控基因mcwc1-c的表達量在6 h時達到峰值，但隨著光照時間的增加，其表達量持續下降，這進一步證實了類胡蘿卜素合成在高光強下的“光適應”機制。

以藍光1000 lx為前提進行光照時間的篩選。本結果表明：培養至18～24 h時，光照18和24 h處理的類胡蘿卜素產量居前2位，且顯著高于其他2個處理的；carB和mcwc1-c的表達量總體上以12～18 h光照處理較高，而carRP的表達量總體上以12 h光照處理較高；所有處理3個基因的表達量均隨著培養時間的增加而呈先上升后下降的變化趨勢。說明長時間光照處理后基因的表達顯著下調，進而導致下游光調控基因carB和carRP的表達量顯著降低。這在其他物種中也有發現，例如在集胞藻(Synechocysticsp.)PCC 6803中，長時間持續光照顯著抑制了葉綠素合成相關基因的表達［19］；在糙脈孢霉中，光照2 h后wc-1基因的表達量達到峰值后顯著下降，藍光感受器WC-1蛋白的合成受到抑制，類胡蘿卜素合成受阻［20］。這些結果均表明光照時間過長可能導致“光適應”，抑制下游色素的合成［21］。綜合類胡蘿卜素的產量以及能耗，本文最終選擇18 h作為卷枝毛霉CBS277.49的最適光照時間。

綜上所述，光照可以促進卷枝毛霉CBS277.49的菌體生長，其中藍光可以顯著促進類胡蘿卜素結構基因的表達，進而增加類胡蘿卜素的合成量。但是長時間、高光強處理會導致結構基因在短暫高表達后迅速降低，阻礙類胡蘿卜素產量的進一步提升。因此，光照誘導卷枝毛霉CBS277.49菌株產類胡蘿卜素的最佳條件為1000 lx藍光持續照射18 h。