低產高級醇桑葚酒發酵工藝優化

廉葦佳，雷 靜，韓 琛，劉志剛，蘇含明，阿依加馬麗·加帕爾，陳 雅

（新疆農業科學院 吐魯番農業科學研究所，新疆 吐魯番 838000）

0 引言

桑葚為桑科落葉喬木植物桑(MorusalbaL.)的果穗［1］，含有豐富的多糖、酸、氨基酸、維生素、微量元素和礦物質，被醫學界譽為“21世紀的最佳保健果品”［2］，具有清除自由基、調節機體免疫功能、降血脂、抗誘變等作用［3］。桑葚酒是以桑葚為原料經酵母菌發酵而成的果酒，市場上銷售的桑葚酒多為配制酒，發酵酒極少，存在飲后打頭、頭暈、頭痛等問題，桑葚酒中高級醇含量過高是導致容易“上頭”的主要原因之一［4］。

高級醇指3個碳以上的一元醇類物質的總稱，其主要成分為戊醇、異戊醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、苯乙醇等［5-7］。高級醇是桑葚酒發酵過程中酵母代謝的副產物，是果酒重要的質量指標［8-9］，也是酒的主要香氣成分、風味物質之一。如果高級醇含量很低則酒的風味單薄，當含量適中時能使酒體豐滿、口感協調［10］。在陳釀、貯藏過程中，高級醇能夠轉化變成酯類，從而使酒體呈現特殊的陳香，給人以醇厚的感覺［11］。然而，當高級醇含量過高時，不僅會對人體產生不良的副作用，還會將異味帶入酒體而影響風味［12-13］。高級醇的毒性隨分子量的增大而增加，且高級醇的中毒和麻醉作用比酒精強［14-15］。據Rappa等［16］報道，當葡萄酒中高級醇總量達到300 mg/L 時，可產生愉快的風味，但當高級醇總量達到400 mg/L 時，則會產生刺激性的口感。含量過高會使酒的風味不協調，苦、澀味增加，飲后易出現神經系統充血，進而引起劇烈的頭暈、頭痛等癥狀［12，17-18］，就是所謂的“上頭”，嚴重時對人體有毒害作用，因此，控制酒中高級醇的含量在適宜的濃度具有重要意義。

發酵因素對酵母菌細胞的生長代謝和發酵產物的積累具有重要影響，發酵條件直接影響著發酵產物的生成量［19-20］，因此可以通過調節桑葚酒發酵條件調控高級醇生成量。酵母菌種［21］、酵母接種量［22-23］、發酵溫度［24-25］、發酵醪液初始pH值［26］、發酵醪液糖度［25］等因素的改變都會導致酵母的代謝途徑和次級代謝產物的生成量發生變化［27-28］。發酵因素對高級醇形成的影響在啤酒、白酒、葡萄酒、白蘭地中已經開展相關研究，但是其具體代謝途徑調控機理尚不明確。釀造過程中發酵因素對高級醇生成量的影響逐漸受到學者們的高度重視，然而不同發酵因素對高級醇生成量的影響效果不一。本研究通過優化發酵條件來控制桑葚酒中高級醇的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑 試驗材料鮮黑桑葚于2022年5月購自新疆吐魯番市高昌區；釀酒高活性干酵母(LALVIN DV10)購自上海杰兔工貿有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級）購自新疆頂峰進出口有限公司；白砂糖購自新疆中唐糖業有限責任公司；果膠酶購自上海康禧食品飲業有限公司；正丁醇、正丙醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇、正戊醇、異戊醇、苯乙醇等色譜純均購自上海安譜實驗科技股份有限公司，異戊醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備 7890B型氣相色譜儀購自安捷倫科技有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ZT/H 打漿機購自烏魯木齊市米東區東霸不銹鋼食品機械配件經銷部；TP-A500型電子分析天平購自美國康州HZ電子有限公司；TD型糖度計購自上海融測電子科技有限公司；PHB-3型pH計購自上海三信儀表廠。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 桑葚酒發酵工藝流程為桑葚→選粒→榨汁→SO2處理→添加果膠酶→調整糖度、酸度→接種→發酵→分離→陳釀→過濾→殺菌→灌裝。

1.2.2 操作要點 首先去除桑葚原料中的爛果、霉果以及樹枝、樹葉、石子等雜物，然后稱取500 g桑葚，用打漿機榨汁，再分別加入SO2（添加量0.03 g/kg)、果膠酶（添加量0.0225 g/kg)和酵母EC118，于20 ℃溫度下進行發酵，在發酵期間2次加入適量白砂糖，并觀察桑葚酒的發酵特性，發酵結束后測定相關指標。

1.2.3 單因素試驗設計 桑葚酒的口感、風味、總高級醇含量等受到發酵溫度、酵母接種量、初始糖度、初始pH值等多種因素的影響，因此，本試驗選取酵母接種量、初始pH值、初始糖度和發酵溫度4個因素進行單因素試驗。

通過預試驗，在酵母接種量為0.25 g/kg、pH值為3.5、發酵溫度為22 ℃、初始糖度為22%的條件下，保持其他條件不變，只改變其中1個因素，以感官評分、總高級醇含量為指標，以發酵時間、酒精度、總糖和總酸為輔助指標，研究不同單因素對桑葚酒感官品質、總高級醇含量的影響。單因素試驗設置酵母接種量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg，pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，初始糖度分別為18%、20%、22%、24%、26%，發酵溫度分別為18、20、22、24、26 ℃，

1.2.4 響應面試驗設計 選取酵母接種量、初始pH值、初始糖度、發酵溫度為主要影響因素，以高級醇含量作為響應值，進行響應面優化試驗，各因素水平編碼如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平和編碼表

1.2.5 測定指標與方法

1.2.5.1 指標測定 使用折光糖度計測定初始糖度；依據《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006)［29］測定酒精度；參照《蒸餾酒與配制酒衛生標準的分析方法》(GB/T 5009.48—2003)［30］中的氣相色譜法測定高級醇含量；參照《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》(GB 12456—2021)［31］中的酸堿滴定法測定總酸含量；參照《食品安全國家標準食品中總糖的測定》(GB 5009.7—2016)［32］中的斐林試劑法測定總糖含量。

1.2.5.2 桑葚酒感官品質評定 參照T/CNFIA 104—2018［22］中桑葚（果）酒的品評標準，以外觀、香氣、滋味、典型性4個指標，對桑葚酒的感官品質進行綜合評價，滿分為100分。由10名專業品評人員組成品評小組，進行感官評定，去掉1個最高分和1個最低分后，取其平均分四舍五入取整數作為感官評分。桑葚酒感官品質評定標準如表2所示。

表2 桑葚酒感官品質評定標準

1.2.6 數據處理 本研究所有試驗和指標測定均進行3次，結果以“平均值±標準差”表示。采用Excel 2007和SPSS 22.0軟件對試驗數據進行處理與回歸分析；采用 Design Expert 8.0.6 軟件進行作圖和響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酵母不同接種量對桑葚酒品質的影響 由表3可以看出，隨著酵母接種量的增大，桑葚酒發酵時間縮短，酒精度增大，總糖含量降低，這是因為酵母接種量越大，酵母繁殖越迅速，進而縮短了發酵時間，消耗了更多的糖用于產生酒精，導致發酵后桑葚酒中總糖含量降低。酵母接種量的增大對桑葚酒總酸含量的影響不顯著。酵母接種量的增大對桑葚酒高級醇含量表現為先降低后升高的趨勢。高級醇是酵母在發酵過程中合成細胞蛋白質的副產物，當接種量增大時，起初酵母增殖倍數小，合成的高級醇較少，隨著酵母接種量的繼續增大，酵母增殖倍數不再變化或者變化很小，合成的高級醇增加［33］。當酵母接種量為0.2和0.3 g/kg時，桑葚酒的風味口感最好，感官評分較高，分別為79.00、80.00分。

表3 酵母接種量對桑葚酒品質的影響

2.1.2 不同初始pH值對桑葚酒品質的影響 由表4可知，隨著初始pH值的增大，酒精度呈現出明顯的先升高后降低的趨勢，因為酵母在適宜的pH值下才能充分活化，過高的初始pH值會抑制酵母活化，導致酒精度下降，較適宜的初始pH值為3.5時，此時產生的酒精度最高,為11.40，總糖含量最低，為12.40%；當初始pH值為3.0和3.5時，總酸含量較大，分別為8.90、8.40 g/L；初始pH值的增大對高級醇含量的影響不顯著，但其值總體偏高；初始pH值的增大對感官評分的影響也不顯著，當初始pH值為3.0和3.5時，感官評分較高，分別為85.00、86.00分。

表4 初始pH值對桑葚酒品質的影響

2.1.3 不同初始糖度對桑葚酒品質的影響 由表5可知，初始糖度的增加對桑葚酒發酵時間的影響明顯，隨著初始糖度的增大，發酵時間整體呈縮短的趨勢。當初始糖度介于18%～24%時，對酒精度的影響顯著，且其值逐漸增大；當初始糖度介于22%～26%時，酒精度增高的趨勢變緩，同時在該范圍內總糖含量增大趨勢明顯，說明初始糖度超過22%時，可能導致發酵液的糖度過高，究其原因一方面是酵母所需底物過剩，另一方面是糖度過大導致發酵液滲透壓升高，進而抑制了酵母的活性，使發酵變緩，同時還會引起其他一些副反應，最終導致桑葚酒口感下降。不同初始糖度對總酸含量的影響不顯著。當初始糖度介于18%～22%時，高級醇含量呈先升高后降低的趨勢；當初始糖度介于22%～26%時，高級醇含量顯著升高。隨著初始糖度的增大，桑葚酒的醇厚味及口感逐漸變好然后下降，當初始糖度介于20%～24%時，桑葚酒的口感較醇厚綿長，感官評分較高。

表5 初始糖度對桑葚酒品質的影響

2.1.4 不同發酵溫度對桑葚酒品質的影響 由表6可知，發酵溫度越高，桑葚酒發酵時間越短，酒精度越高。當發酵溫度在20～26 ℃時，酒精度均在10% vol以上，符合桑葚果酒酒精度的要求；當發酵溫度在22、24 ℃時，桑葚酒中總糖含量較高，分別為23.50%、22.30%；隨著發酵溫度的升高，總酸含量變化不顯著；隨著發酵溫度的升高，高級醇含量呈先降低后升高的趨勢，當發酵溫度在18～22℃時，高級醇含量較低；隨著發酵溫度的升高，桑葚酒的感官評分呈先升高后降低的趨勢，當發酵溫度在20～24 ℃時，桑葚酒口感、滋味、香氣等指標均較好。

表6 發酵溫度對桑葚酒品質的影響

2.2 響應面法優化桑葚酒發酵工藝

根據單因素試驗結果，以桑葚酒中高級醇含量為響應值，選用酵母接種量、初始pH值、初始糖度和發酵溫度4個因素進行4因素3水平Box-Behnken響應面優化試驗。

2.2.1 模型的建立與分析 根據單因素試驗結果，經Design Expert 8.0.6統計分析軟件設計出的29個桑葚酒發酵工藝試驗方案及結果如表7所示。

表7 響應面試驗設計結果

利用Design Expert 8.0.6 統計軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到高級醇含量(Y)對自變量酵母接種量(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)、發酵溫度(D)之間的二次多項回歸模型為：

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 由高級醇響應面回歸模型方差分析（表8）可以看出：回歸方程的模型擬合程度好，由這4個因素及其二次項能較好地預測試驗結果。對于模型來說，F值為266.36，P＜0.0001，表示擬合獲得的回歸模型極顯著，回歸模型與實測值擬合程度好，可信度高，可用該回歸方程替代試驗真實點值對試驗結果進行分析。失擬項的F值為1.37，P=0.4090(P＞0.05)，即失擬項不顯著，說明該回歸方程能夠充分反映實際情況。模型的決定系數R2=0.9963，校正決定系數R2adj為0.9925，為總變異的1.53%，說明試驗值與模型回歸值一致性良好，該模型能夠解釋0.9925的響應值變化，試驗誤差較小，可以用此模型分析并預測桑葚酒發酵過程中高級醇的含量。上述回歸方程各項方差分析結果表明：酵母接種量、初始糖度、發酵溫度、酵母接種量與初始糖度的交互、初始pH值與發酵溫度的交互、初始糖度與發酵溫度的交互對桑葚酒高級醇含量的影響極顯著；初始pH值對桑葚酒高級醇含量的影響不顯著。C2和D2的P值均小于0.01，說明C2和D2對桑葚酒高級醇含量均有極顯著的影響；初始pH值與初始糖度的交互和B2的P值均小于0.05，說明初始pH值與初始糖度的交互和B2對桑葚酒高級醇含量均有顯著影響。

表8 高級醇含量回歸模型方差分析及顯著性檢驗

2.2.3 響應面分析 由圖1和圖2可以看出，各因素間交互作用的響應曲面圖上均存在最優值，其中酵母接種量、初始糖度、發酵溫度、酵母接種量與初始糖度交互、初始pH值與發酵溫度交互、初始糖度與發酵溫度交互的側剖面圖弧度比初始pH值的側剖面弧度更大，說明酵母接種量、發酵溫度和初始糖度對模型的影響比初始pH值大。由圖1可知，初始糖度分別和酵母接種量、發酵溫度的等高線圖更接近于橢圓，且其響應面圖陡峭，說明初始糖度與兩者的交互作用極顯著，桑葚酒高級醇含量隨著初始糖度和酵母接種量的增加而增加，當高級醇含量達到極值后，又隨著初始糖度和酵母接種量的增加而逐漸降低；初始pH值與發酵溫度的等高線圖也接近于橢圓，且其響應面圖陡峭，初始糖度與發酵溫度的交互作用極顯著，桑葚酒高級醇含量隨著初始pH值與發酵溫度的增加而增加，當高級醇含量達到極值后，又隨著初始pH值與發酵溫度的增加而逐漸降低；初始pH值與初始糖度交互的等高線圖接近于橢圓，其響應面圖較陡峭，說明初始pH值與初始糖度的交互作用顯著。由圖2可知，6個響應面圖中均存在響應值的最優值，所選擇的試驗范圍屬于極值附近的小范圍，符合響應面適用條件，6個響應面圖側剖面的弧度顯示酵母接種量、初始糖度和發酵溫度的弧度均較大；酵母接種量和初始pH值、酵母接種量和發酵溫度這2個交互作用的等高線圖趨近圓形，說明其對桑葚酒高級醇含量模型的影響不大。

圖1 各因素間的交互作用對桑葚酒高級醇含量影響的等高線圖

圖2 各因素間的交互作用對桑葚酒高級醇含量影響的響應曲面圖

2.2.4 桑葚酒發酵最優工藝和驗證試驗 通過Box-Behnken試驗，根據Design Expert 8.0.6.統計軟件分析優化得到基于高級醇含量響應面模型的桑葚酒最佳發酵工藝為：酵母接種量0.21 g/kg，初始pH值3.07，初始糖度22.12%，發酵溫度22.06 ℃，在該工藝條件下，桑葚酒高級醇含量為306.988 mg/L。結合實際條件，將發酵工藝條件調整為：酵母接種量0.2 g/kg，初始pH值3.1，初始糖度22%，發酵溫度22 ℃，進行3次平行驗證試驗，得到桑葚酒高級醇含量為308 mg/L，與預測值的相對偏差在1%以內，表明本試驗建立的響應面法優化模型能夠很好地預測桑葚酒發酵的高級醇含量，本研究得到的工藝條件客觀合理。

孫時光［4］采用單因素試驗與L9(34)正交試驗對桑葚果酒的發酵條件進行了優化，在初始糖濃度21°Brix、發酵溫度25 ℃、酵母接種量7%的最佳發酵條件下，桑葚果酒高級醇含量較低，為 325.49 mg/L；羅惠波等［34］通過單因素試驗和響應面試驗調控了桑葚酒中高級醇的生成量，在初始pH值3.8、發酵溫度24 ℃、酵母接種量8.0×106cell/mL的最佳工藝條件下，高級醇的生成量為357.06 mg/L，與常規發酵條件下的生成量相比降低了13.07 %；William等［35］采用Box-Behnken設計，研究了在發酵溫度25 ℃、pH值4、接種量10%(v/v)和糖度26%的優化發酵條件下桑葚酒高級醇濃度為249.91 mg/L。本試驗低產高級醇桑葚酒最佳發酵工藝與上述桑葚酒發酵工藝均不同，主要為地域、氣候、土壤、環境、品種、桑葚原料蛋白質、糖類含量、代謝產物轉化途徑、工藝參數等的差異，且發酵所用酵母菌的種類和數量也不一樣，進而導致在桑葚酒發酵過程中降低高級醇含量的工藝也不同。

3 結論

本研究采用以高級醇含量為響應值的響應曲面法優化了桑葚酒發酵的最優條件，結合實際條件并通過驗證試驗得到桑葚酒的最佳發酵工藝條件為：酵母接種量0.2 g/kg，初始pH值3.1，初始糖度22%，發酵溫度22 ℃，在該條件下發酵桑葚酒的高級醇含量為308 mg/L，預測結果與驗證結果相差0.33%，表明優化桑葚酒高級醇含量的數學模型建立成功，與常規發酵工藝相比，高級醇含量降低了31.55%。因此，將響應曲面法應用于優化桑葚酒調控高級醇最優發酵工藝條件，能夠獲得真實可靠的結果，可用于指導生產實踐。