壯骨健膝方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)兔滑膜成纖維細(xì)胞炎癥模型的影響

張英杰，張鵬，肖艷，劉俊，陳雨，邱夢婷，蘇友新*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，病變部位可累及整個(gè)關(guān)節(jié)組織，病理變化主要包括軟骨退變、滑膜炎癥和軟骨下骨重塑異常等［1］。滑膜炎癥是關(guān)節(jié)持續(xù)退行性變的主要驅(qū)動(dòng)因素，也是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和僵硬等臨床癥狀的主要原因，在KOA的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色［2］。滑膜成纖維細(xì)胞（fi-broblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是滑膜炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，在其炎癥狀態(tài)下可分泌大量促炎細(xì)胞因子［3］，同時(shí)表現(xiàn)為過度增殖、侵襲等腫瘤樣特性［4］，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨等組織造成損傷。核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號(hào)通路被激活后參與KOA滑膜炎癥的發(fā)生、發(fā)展［5］。抑制滑膜炎癥延緩膝關(guān)節(jié)病理改變、改善患者癥狀是目前治療KOA的重要環(huán)節(jié)。壯骨健膝方是課題組基于KOA“痹痿并見”的中醫(yī)特點(diǎn)總結(jié)的臨床效驗(yàn)方，可顯著減輕患者膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、行走無力等痹證、痿證的臨床癥狀［6］，前期在動(dòng)物水平上的研究表明該方可顯著改善KOA滑膜炎模型兔滑膜內(nèi)襯層細(xì)胞增生及炎性細(xì)胞浸潤等病理變化，減少關(guān)節(jié)液中炎癥指標(biāo)含量，減輕炎癥反應(yīng)［7］。本研究以兔FLS為研究對(duì)象，體外建立炎癥模型，觀察壯骨健膝方對(duì)模型的影響，以期在細(xì)胞水平上進(jìn)一步闡明該方對(duì)KOA滑膜炎癥的干預(yù)效應(yīng)及部分機(jī)制，為其臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 12只3月齡普通級(jí)健康新西蘭大白兔，體質(zhì)量（2.05±0.27）kg，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購并飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。兔滑膜成纖維細(xì)胞（批號(hào)：CP-Rb017）由武漢普諾賽生命科技有限公司提供，本研究方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：FJTCM IACUC 2019060）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 壯骨健膝方（骨碎補(bǔ)15 g，川牛膝12 g，生地黃15 g，杜仲9 g，獨(dú)活6 g，雞血藤15 g，秦艽9 g，徐長卿9 g，?蟲6 g），由福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定，所用藥材均符合《中華人民共和國藥典（2020年版）》質(zhì)量要求。常規(guī)煎煮中藥并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液至含生藥量1 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號(hào)：PYG0072）；脂多糖（中國Biosharp公司，批號(hào)：BS904）；胎牛血清（澳洲ExCell Bio公司，批號(hào)：11G362）；兔白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒，均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)分別MM-030501、MM-024001、MM-030201；Cell Counting Kit-8試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：AR1160-500）；NF-κB p65、核因子κB抑制因子α（IκBα）抗體，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-0465R、bs-1287R；β-actin、Histone-H3內(nèi)參抗體、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG，均購自美國Proteintech Group公司，批號(hào)：66009-1-Ig、17168-1-AP、10205-2-AP、SA00001-1、SA00001-2；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物科技研究所，批號(hào)：AR0146、AR1112）；Simply P總RNA提取試劑盒（北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：BSC52S1）；核液抽提分離試劑盒（美國APExBIO公司，批號(hào)：K1137）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 倒置相差顯微鏡（德國LEICA公司）；低速離心機(jī)（湖南湘儀儀器有限公司）；Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；低溫高速離心機(jī)（美國BECKMAN公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國Herarus公司）；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-TEK公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；-80℃超低溫冰箱（德國Eppendorf公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清與空白血清的制備 12只新西蘭大白兔，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為壯骨健膝方組和空白組，每組6只，結(jié)合前期研究并參照人與動(dòng)物體質(zhì)量換算等效劑量的方法［8］，壯骨健膝方組按4.58 mL/（kg·d）灌胃，空白組給予等劑量生理鹽水灌胃，持續(xù)3 d。于末次灌胃1 h后，20%烏拉坦（5 mL/kg）腹腔注射麻醉成功后行腹主動(dòng)脈采血。全血靜置4 h后，2 500 r/min離心30 min，分離血清并在56 ℃水浴滅活30 min，用0.22 μm無菌過濾器過濾，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將兔滑膜成纖維細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2 d更換1次培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 兔滑膜成纖維細(xì)胞炎癥模型的制備 取對(duì)數(shù)生長期的兔滑膜成纖維細(xì)胞，以1×105/mL的密度均勻接種到24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)待其貼壁后隨機(jī)分為空白組與模型組，參考相關(guān)文獻(xiàn)［9］并結(jié)合前期預(yù)試驗(yàn)，空白組給予完全養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，模型組給予含1.0 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，36 h后ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量變化，CCK-8法檢測細(xì)胞生存率變化。與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α含量顯著增加（P＜0.05），細(xì)胞生存率顯著升高（P＜0.05）。符合滑膜成纖維細(xì)胞炎癥狀態(tài)下分泌大量促炎因子及過度增殖的特性，見表1。

表1 脂多糖刺激滑膜成纖維細(xì)胞后IL-1β、TNF-α含量及細(xì)胞生存率比較（）

表1 脂多糖刺激滑膜成纖維細(xì)胞后IL-1β、TNF-α含量及細(xì)胞生存率比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05。

細(xì)胞生存率/%100.00±2.11 115.58±5.061）組別空白組模型組n3 3 IL-1β/（pg/mL）43.19±2.40 302.37±9.911）TNF-α/（pg/mL）56.93±3.29 446.59±9.151）

2.4 篩選壯骨健膝方含藥血清干預(yù)炎癥模型的最佳濃度和時(shí)間 滑膜成纖維細(xì)胞炎癥模型的制備方法同2.3，炎癥模型制備成功后隨機(jī)分為0%、5%、10%、20%壯骨健膝方含藥血清組，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，給予對(duì)應(yīng)濃度的含藥血清分別干預(yù)12 h、24 h、48 h后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞生存率。選擇細(xì)胞生存率接近50%的藥物濃度和干預(yù)時(shí)間做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳干預(yù)條件［10］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇細(xì)胞相對(duì)生存率接近50%的濃度為10%，時(shí)間為48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)條件，見表2。

表2 不同濃度壯骨健膝方含藥血清干預(yù)模型不同時(shí)間后細(xì)胞生存率比較（）

表2 不同濃度壯骨健膝方含藥血清干預(yù)模型不同時(shí)間后細(xì)胞生存率比較（）

注：與0%組同時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.05。

干預(yù)48 h 100.00±1.29 72.29±3.361）51.25±2.971）36.19±3.271）組別0%組5%組10%組20%組n3 3 3 3干預(yù)12 h 100.00±1.23 96.52±2.02 85.70±3.211）72.21±3.191）干預(yù)24 h 100.00±1.17 86.92±1.621）66.65±2.431）57.81±2.011）

2.5 分組及干預(yù) 取對(duì)數(shù)生長期的兔FLS，隨機(jī)分為空白組、造模組，造模組按照“2.3”實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件復(fù)制炎癥模型后隨機(jī)分為模型組與壯骨健膝方組，分別給予空白血清、空白血清、10%壯骨健膝方含藥血清干預(yù)48 h，干預(yù)結(jié)束后收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液進(jìn)行相關(guān)檢測。以下實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2.6 各組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量檢測 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，離心20 min（3 000 r/min）后，獲取上清液，按照ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格操作，通過全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀獲得450 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，根據(jù)曲線公式計(jì)算各組IL-1β、TNF-α、IL-6含量。

2.7 各組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA、IκBα、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平檢測 采用qPCR法檢測。收集各組細(xì)胞，采用柱式法提取各組細(xì)胞總RNA并進(jìn)行濃度測量，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶HiScript Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）說明書依次進(jìn)行配制逆轉(zhuǎn)錄體系、去除樣本中殘留的DNA、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，對(duì)cDNA進(jìn)行相同比例稀釋后取2 μL加入到ChamQ SYBR qPCR Msater Mix反應(yīng)體系中進(jìn)行qPCR檢測，以變性95 ℃ 30 s、退火95 ℃ 10 s、延伸60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)為運(yùn)行條件，獲得各基因的CT值后，采用2-△△CT法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。基因引物序列由福建尚亞生物工程有限公司合成，詳見表3。

表3 引物序列

2.8 各組細(xì)胞中PCNA、IκBα及核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)的檢測 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉1小時(shí)，一抗（PCNA、IκBα、NF-κB p65稀釋比例均為1∶2 000）4 ℃環(huán)境下孵育過夜，PBST洗滌3次，每次10 min；二抗（HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG稀釋比例均為1∶5 000）室溫條件下孵育1小時(shí)，PBST洗滌3次，每次10 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影成像后，采用Image J軟件對(duì)膠片條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)方法 利用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，2組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用單因素方差分析；計(jì)量資料不符合正態(tài)分布者，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，以上統(tǒng)計(jì)方法均采用雙側(cè)檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較 與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表4 3組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較（）pg/mL

表4 3組細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較（）pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

IL-6 27.50±1.08 192.37±8.221）107.61±6.092）組別空白組模型組壯骨健膝方組n3 3 3 IL-1β 43.15±1.67 309.63±9.261）179.56±6.932）TNF-α 76.01±1.97 464.78±22.761）259.54±10.992）

3.2 3組細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表5 3組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（，n＝3）

表5 3組細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（，n＝3）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

PCNA 1.02±0.26 2.65±0.311）1.75±0.152）組別空白組模型組壯骨健膝方組n3 3 3 IL-1β 1.01±0.12 5.16±0.661）2.03±0.312）TNF-α 1.01±0.13 8.91±1.901）4.12±0.432）IL-6 1.00±0.09 4.53±0.481）1.89±0.412）

3.5 3組細(xì)胞IκBα、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組NF-κB p65 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05），IκBα mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），IκBα mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見表6。

表6 3組細(xì)胞IκBα、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（）

表6 3組細(xì)胞IκBα、NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

NF-κB p65 1.01±0.14 2.81±0.341）1.85±0.492）組別空白組模型組壯骨健膝方組IκBα 1.02±0.23 0.28±0.041）0.62±0.142）

3.6 3組細(xì)胞中PCNA、IκBα、核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組PCNA及核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），IκBα蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組核內(nèi)PCNA及NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），IκBα蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表7。

圖1 3組細(xì)胞中PCNA、IκBα、核內(nèi)NF-κB p65蛋白條帶圖

表7 3組細(xì)胞中PCNA、IκBα、核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)量比較（）

表7 3組細(xì)胞中PCNA、IκBα、核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)量比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組壯骨健膝方組NF-κB p65/Histone-H3 0.39±0.01 0.87±0.021）0.70±0.022）PCNA/β-actin 0.49±0.02 1.06±0.041）0.75±0.032）IκBα/β-actin 0.76±0.04 0.37±0.021）0.68±0.022）

4 討 論

中醫(yī)認(rèn)為KOA的核心病因病機(jī)為肝腎虧虛、風(fēng)寒濕邪侵襲，證屬本虛標(biāo)實(shí)，病理及臨床表現(xiàn)上均存在痹痿兩面，其中滑膜炎癥、膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等屬痹證范疇，關(guān)節(jié)軟骨退化、膝周肌肉萎縮無力等屬痿證范疇，具有“痹痿并見”“痹痿同病”特點(diǎn)，并且痹痿可相互影響，導(dǎo)致KOA病情反復(fù)，遷延難愈［11］，治療上當(dāng)“痹痿并重”“除痹起痿”［12］。壯骨健膝方是課題組經(jīng)多年臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究，總結(jié)出契合KOA“痹痿并見”“痹痿同病”特點(diǎn)的效驗(yàn)方，方中諸藥配合，達(dá)到痹痿共治、除痹起痿之功效。課題組前期研究表明［13］，該方能夠降低退變軟骨細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平，抑制信號(hào)通路的激活，減少下游效應(yīng)產(chǎn)物MMP-13、IL-1β、TNF-α 等細(xì)胞因子的表達(dá)，延緩軟骨退化，從“起痿”的角度闡釋了該方對(duì)KOA的治療作用。滑膜炎癥存在于KOA病程的所有階段［14］，已經(jīng)成為KOA發(fā)病發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［15］，課題組前期通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［7］已證實(shí)壯骨健膝方可以減輕兔膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥模型中炎癥因子的分泌，改善滑膜組織炎癥；本研究制備兔FLS炎癥模型，進(jìn)一步闡明壯骨健膝方“除痹”的功效及其部分機(jī)制。

LPS可引發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的免疫反應(yīng)，廣泛用于炎癥模型的建立［16］。FLS在體外可被LPS誘導(dǎo)為炎癥模型并表現(xiàn)為過度增殖的特性［17］，本研究中，兔FLS經(jīng)LPS刺激后分泌的炎癥因子IL-1β、TNF-α顯著增多，增殖能力顯著增強(qiáng)，符合滑膜成纖維細(xì)胞的炎癥特點(diǎn)。造模后模型組細(xì)胞各炎癥因子含量及mRNA表達(dá)顯著提高；細(xì)胞相對(duì)生存率、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） mRNA及蛋白表達(dá)顯著增高，細(xì)胞過度增殖；而通過壯骨健膝方含藥血清干預(yù)可減輕兔FLS炎癥反應(yīng)并抑制其過度增殖，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實(shí)了該方可減輕滑膜炎癥，發(fā)揮“除痹”功效。

關(guān)于壯骨健膝方減輕兔FLS炎癥的作用機(jī)制，本研究亦進(jìn)行了初步探討。NF-kB信號(hào)通路主要參與炎癥反應(yīng)、增殖、凋亡等，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，IκBα磷酸化并進(jìn)一步泛素化后被降解，導(dǎo)致NF-κB活化并向細(xì)胞核內(nèi)移位，轉(zhuǎn)錄IL-1β、TNF-α等下游產(chǎn)物，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［18］。本研究結(jié)果顯示，模型組IκBα蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低，核內(nèi)NF-kB p65蛋白及NF-kB p65 mRNA表達(dá)顯著升高，并且伴隨著下游指標(biāo)IL-1β、TNF-α、IL-6含量及mRNA表達(dá)的升高，提示NF-κB信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。而壯骨健膝方組IκBα蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高，核內(nèi)NF-kB p65蛋白及NF-kB p65 mRNA表達(dá)顯著降低，并且伴隨著下游指標(biāo)IL-1β、TNF-α、IL-6含量及mRNA表達(dá)的降低，同時(shí)PCNA蛋白及mRNA表達(dá)也顯著降低。以上結(jié)果提示，壯骨健膝方對(duì)兔FLS炎癥模型“除痹”的作用機(jī)制可能與抑制NF-kB信號(hào)通路激活有關(guān)。這與我們前期在組織水平上研究的結(jié)果相同［19］，進(jìn)一步印證了壯骨健膝方防治KOA滑膜炎癥的作用機(jī)制與抑制NF-kB信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，壯骨健膝方含藥血清可有效降低炎癥FLS IL-1β、TNF-α等促炎因子表達(dá)并抑制其細(xì)胞過度增殖，發(fā)揮“除痹”功效，其作用機(jī)制可能與抑制NF-kB信號(hào)通路激活有關(guān)，從細(xì)胞水平上進(jìn)一步闡明了該方對(duì)KOA滑膜炎癥的干預(yù)效應(yīng)及部分療效機(jī)制。NF-kB信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡亦存在一定的關(guān)系，但在本研究中尚未進(jìn)行相關(guān)的探討，這將成為課題組今后研究的內(nèi)容之一。